原代细胞如何获取？

原代细胞(primary cell)：是指从机体的组织(如人组织、小鼠组织、大鼠组织和兔组织等)经蛋白酶或其它的方法获得单个细胞并在体外进行模拟机体培养的细胞，称为原代细胞。一般认为，培养的原代的第1代细胞和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。

原代细胞的获取难度大、需要考虑的问题多，原代细胞如何获取？

原代细胞的获取，就是从活体上将组织分解成单个细胞再进行培养的过程，且整个过程要求无菌操作。具体要考虑的问题有：组织分解的方式，培养的时间，换液时间，细胞状态判断和冻存。

一、组织分解的方式

将组织分解成单个细胞的方式目前主要有两种：酶消化法和组织块法（针对贴壁细胞）。

1. 酶消化法：所用试剂：胶原酶和胰酶。

 胶原酶的选择：（根据自己的组织样本选择合适的胶原酶是实验成功的大前提。）

胶原酶的配制：常用的是DMEM进行配制，配制好的胶原酶消化液放置在37℃水浴锅内预热（注意现用现配）。

胶原酶消化时间：根据组织特性，消化时间会有差异。以小鼠肾细胞为例，加入胶原酶Ⅰ进行消化后，放入37℃培养箱中消化45min~1h左右，期间每隔10min中震荡一次，知道组织块几乎wan全消失为止（若是组织块剪得非常细小，时间可以短一些，30min左右即可）。

培养过程：注意原代细胞在培养2天后可能会出现细胞液变黄（橘黄色）的现象，且无漂浮物，这是正常现象哦，不是污染。这是由于细胞在贴壁生长过程中释放了CO2和其他物质导致培养液PH发生了改变，所以变黄。

2. 组织块法

取材：取组织中间部位，剪成大小均匀的小方块（1~4mm²），清洗干净后转移至培养皿中，在培养皿中各组织块要排列均匀。 

加液：培养液不能浸没组织块，避免组织漂浮。然后培养4h左右加培养液，培养48h后换液。

二、培养时间

无论是酶消化法还是组织块法，取样后培养时间最少需要一周以上的时间，期间可换液或者传代。

三、换液时间

无论酶消化法还是组织块法，在培养期间需要随时关注细胞的生长状况，需观察其是否贴壁，是否污染，组织块法要观察是否有细胞迁移出来。正常情况下48~72h可换液一次。

四、细胞状态判断

正常贴壁细胞在培养几天后，会逐渐贴满整个瓶底或者皿底，有的呈纤维状，有的呈多边形。这些细胞的状态比较好，生长至80%~90%融合就可以传代啦，传代一次后的细胞会更干净漂亮。

五、冻存

传一代后的细胞（也可以不传代直接冻存）培养至80%~90%便可冻存起来供后续实验用。

冻存液配制：不同的细胞可能会有不同的冻存液配制方案，各实验室也有自己的冻存方案，

常见的方案有：

a: 10%DMSO+90%的FBS；

b: 10%DMSO+40%FBS+50DMEM；

c: 5%DMSO+45%DMEM+50%FBS 。

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