如何选择荧光蛋白？

荧光标记在生物学众多的研究领域中有着十分广泛的应用，已经成为研究体内或细胞成像及生物细胞功能的重要工具。荧光标记方式一般有两种，一种是细胞表达的荧光蛋白，另外一种是化学合成的荧光分子，此外，萤光素酶也是细胞标记的常用方法。每一种荧光分子都有其独te的激发波长和发射波长。萤光素酶不同于荧光分子，其发光机制是利用酶与底物的反应，催化发出的化学发光，其发光并不需要激发光的参与，常用于体内成像及萤光素酶报告基因的定量实验。荧光蛋白如何选择呢？让我们一起来看看吧！

一、激发波长/发射波长

每一种荧光蛋白都有其独te的激发波长和发射波长，因此，选择的荧光蛋白必须是手上系统能够激发和检测得到的。举例，如果你的显微镜只有488nm和561nm两个激发器，那你就不能够选择远红外荧光蛋白。又比如当使用不止一个荧光蛋白时，确保他们的发射波长没有重叠，建议荧光使用先后顺序，GFP/RFP/BFP/YFP/CFP。

二、寡聚反应

第一代荧光蛋白易于寡聚化，当和目的基因融合表达时，可能会影响目的基因蛋白的生物学功能。因此做融合表达时建议使用单体的荧光蛋白，比如mCherry/EGFP。

三、氧气

许多荧光蛋白的成熟需要氧气，特别是衍生自GFP的那些荧光蛋白，如EGFP/ECFP/EYFP。如果这些荧光蛋白处于缺氧环境，那可能就观察不到荧光。

四、成熟时间

成熟时间是荧光蛋白正确折叠和产生发色团所需的时间，时间可能是几分钟到几小时。举例：superfolder GFP (sfGFP) 和mNeonGFP在37°C所需时间小于10min；mCherry 需要大概15min；TagRFP 需要大概100min；DsRed 大概需要10hours。

五、温度

温度会影响荧光蛋白的成熟时间和荧光强度，比如EGFP适合37°C，所以EGFP最shi合哺乳动物或者细菌的研究，而GFPS65T相对适合酵母的研究。

六、亮度

荧光蛋白的亮度值由消光系数与量子产率的乘积计算得出。在许多情况下，将荧光蛋白的亮度与EGFP(设定为1)进行比较，有一些荧光蛋白非常暗淡（例如TagRFP657，其具有亮度只有0.1），因此亮度也需要考虑。

七、耐光性

长时间暴露在激发光下，荧光分子被漂白（即失去发光的能力）。光稳定性可短至100毫秒（如EBFP）或长达1小时（如mAmetrine1.2）。但是，对于大多数荧光蛋白来说，它只需几秒钟到几分钟。另外，光稳定性可能也会受实验参数影响，例如激发光强度，pH或温度等。

八、pH稳定性

如果计划在酸性环境中表达荧光蛋白，则此参数非常重要，一些荧光蛋白具有不同的ex/em光谱（例如mKeima）或在pH变化时荧光强度会发生改变（例如pHluorin，pHTomato），sensGFP在酸性环境会淬灭，如StubRFP-SensGFP-LC3B自噬探针。

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