免疫荧光（IF）实验常见问题有哪些？解决方案有什么？

免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。那么你知道在免疫荧光（IF）实验中会遇到那些问题以及这些问题的解决方法吗？让我们一起来看看吧！

问题一：目标蛋白荧光很弱，导致组间差异不显著，导致假阴性结果

解决方案：出现这种情况后，首先检查抗体是否正确，是否适用于预处理的组织。有些抗体只适用于冰冻切片，但如果应用于石蜡切片，则会出现弱标记或无标记现象。然后通过文献了解目的蛋白在组织或细胞中的表达丰度。此外，如果抗体修复不足，抗原表位未完quan暴露，也会出现弱标记。例如，虽然大多数抗体在酸性环境中修复，但也有少数抗体需要在碱性环境中修复。建议查看抗体说明书，严格按照其修复条件进行实验。

问题二：目标蛋白的荧光过强，甚至形成非特异性的标记，一些背景染色可能被误认为阳性区域，造成假阳性结果

解决方法：适当降低一抗或者二抗的浓度，增加漂洗时间，一般能够有所改善

问题三：DAPI 染细胞核时，加入的试剂太多，造成高背景染色

解决方法：滴加的 DAPI 不要太多，只需覆盖上薄薄的一层即可。

问题四：组织切片预处理不当或采用石蜡切片，导致高背景染色

解决方案：如果组织切片，尤其是石蜡切片脱蜡环节不彻di，也会造成区域性的非特异性标记。建议脱蜡一定要彻di，脱蜡前充分烤片也可以帮助脱蜡。实验过程中，玻片干燥了，同样会造成高背景或大面积的非特异性标记。漂洗环节和抗体孵育环节最容易出现干片现象，尤其是大批量实验时，一定要注意。使用免疫组化专用笔画个圈，可以有效改善。

问题五：采集图像过程不当，导致原始图像不佳，直接影响后续半定量分析

解决方案：采集图像时不要对每一张图像都加上标尺，否则后期采用 Image J或者 IPP 进行分析时，这些标尺会对结果造成影响。采集图像时，速度要快。如果激发光很长时间对准目标区域，此区域内的荧光衰减会极快因此，目标区域较小时，一定要尽量快速采集，减少人为实验误差。

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