蛋白质纯化有哪些步骤呢？

蛋白质纯化是利用基因工程技术将编码蛋白质的核酸序列导入宿主细胞，使其大量表达，然后采用合适的纯化方法进行体外纯化，以获得高纯度、高活性和高产量的蛋白质的过程。那么你知道蛋白质纯化操作步骤吗？让我们一起来看看吧！

1、构建原核表达质粒：目的基因PCR，载体酶切，连接，转化，挑单克隆送测序；

2、将构建成功的质粒转化到BL21（DE3）中，37℃培养过夜，挑单克隆小摇过夜；

3、小诱导摸索最佳诱导条件：将摇过夜的菌液1:1000接种到3mL LB中，37℃摇4-5h至菌液OD600=0.6-0.8，加入不同浓度IPTG（0.1-1mM），不同温度下诱导，随着温度降低，诱导时间延长，如37 ℃ 诱导4-5h，30°C诱导6h-8h，16°C诱导16-20h，取不同诱导条件下诱导前和诱导后的菌液，跑胶，考染，观察诱导结果；（一般来说，IPTG浓度越低，诱导温度越低，目的蛋白表达越慢，越利于蛋白质的正确折叠从而增加其可溶性，减少包涵体的产生）

4、找到最适诱导条件后，将菌液1:1000接种到2L的LB中，37℃摇至菌液OD600=0.6-0.8，吸出20μL菌液留待跑胶(1)，然后在预实验得到的合适的诱导条件下诱导蛋白表达，吸出20μL菌液留待跑胶(2)；

5、取出诱导后的菌液，4000g，4℃离心15min；

6、弃上清液，称重，每克菌加入10mL Lysis buffer（1:100加蛋白酶抑制剂），重悬，冰上放置约30min；

7、压力破碎：放掉高压均质仪中的酒精，用水冲两遍，用Lysis buffer平衡一遍，加入菌液，加压（压力不要超过800kpa），菌液过三到五遍至透明不粘稠；

8、收集破碎后的菌液，12000g，4℃离心20min，将上清和沉淀分离，各留取20μL样品(3)(4)待跑胶；

9、将2mL Ni-NTA加入纯化柱，待乙醇滤过，用水冲洗，加入Lysis buffer平衡柱子；

10、用Lysis buffer将Ni-NTA重悬加入上清中，混匀，4℃摇床孵育2h；

11、将上清液4℃过柱，收集滤过液20μL(5)；

12、用5mL Wash buffer洗柱子3次，收集滤过液样品20μL(6)；

13、加入1mL Elution buffer，孵育5min，收集洗脱液，重复5次，收集5mL洗脱液于同一管中，留取20μL样品(7)；

14、将实验过程中得到的各个蛋白样品跑胶，考马斯亮蓝染色1h，脱色至背景蓝色较浅，可见清晰蛋白条带；

15、分析各个样品的蛋白条带情况，根据结果进行后续操作：若洗脱蛋白样品中蛋白无杂带或杂带少且浅，可进行透析与浓缩，若杂带多则需要再次纯化后进行透析与浓缩。

16、透析：将样品加入透析膜中，两端夹紧，4℃透析过夜；

17、浓缩：根据样品分子量大小选择合适的浓缩管4℃低速浓缩，浓缩后测蛋白浓度，分装标记，在液氮中速冻，然后冻存于-80℃冰箱。

更多有关蛋白质纯化操作步骤的问题，请联系天津益元利康生物科技有限公司：