细胞传代的实验步骤是什么？有何注意事项？

在细胞培养过程中，去除原培养基并将细胞从原培养体系转移到新鲜的培养基中，维持细胞的活力与增殖。细胞传代既可以扩大细胞培养量，也能够避免细胞因进入平台期而出现生长抑制甚至死亡的情况。那么你知道细胞传代的实验步骤是什么吗？有何注意事项呢？让我们一起来看看吧！

一、实验步骤

1. 贴壁细胞的传代:

1) 倒置显微镜下观察细胞形态及密度，评估细胞的状态，以作为传代比例的参考。

2) 提前紫外杀菌（至少30min为宜）操作台及实验材料。

3) 注意无菌操作，在操作台中吸除或倒掉培养皿内旧培养液（尽可能去除干净，钙离子、镁离子和血清蛋白的存在会降低胰酶活力）。

4) 加入适量PBS缓冲液洗涤1~2次。

5) 加入1~2 mL胰酶（以全部覆盖细胞为准），轻轻晃动培养皿，使胰酶充分接触细胞（建议：胰酶分装成适量，提前水浴复温到37℃）。

6) 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞，当细胞变圆且大多数细胞脱落时，表明此时细胞消化适度（加入胰酶后，边计时边显微镜下观察，记录细胞消化的时间，供今后细胞消化参考）

7) 加入2~3 mL 含血清完quan培养液（也可以考虑使用该细胞本次的培养上清），终止消化，轻柔吹打，使细胞完quan脱落。

8) 收集细胞悬液，转移至离心管中，1500 rpm 离心5 min（必要时可以考虑，低速、短时间的离心有助于去除细胞碎片、细菌污染等）。

9) 弃去上清液，加入适量体积含血清培养液，重悬细胞，根据细胞生长速度、是否有密度依赖性及计划传代的时间等特点，按照比例将细胞悬液分装入2个或多个无菌培养皿/培养瓶内，培养皿内可预先加入适量培养基。注意细胞充分混匀，保证细胞均匀分布。 

2. 悬浮细胞的传代：可通过离心收集后用含血清的培养基直接传代。

二、注意事项

1. 严格无菌操作！

2. 适度消化：提前复温胰酶37℃以及消化计时，易保证消化过程稳定。消化时间过长，容易影响细胞状态及活性，消化时间过短易多细胞成团，影响实验效果。

3.吹打过程要轻柔，避免细胞液的洒溅。

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