你知道荧光原位杂交实验的方法与步骤是什么吗？

荧光原位杂交是一门新兴的分子细胞遗传学技术，目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。那么你知道荧光原位杂交实验的方法与步骤是什么吗？让我们一起来看看吧！

一、探针变性

将探针在 75℃恒温水浴中温育 5 min，立即置 0℃，5～10 min，使双链 DNA 探针变性。

二、标本变性

（1）将制备好的染色体玻片标本于 50℃培养箱中烤片 2～3 h。（经 Giemsa 染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。

（2）取出玻片标本，将其浸在 70～75℃的体积分数 70% 甲酰胺/2×SSC 的变性液中变性2～3 min。

（3）立即按顺序将标本经体积分数 70%、体积分数 90%和体积分数 100%冰乙醇系列脱水，每次 5 min，然后空气干燥。

三、杂交

将已变性或预退火的 DNA 探针 10 μL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上 18×18 盖玻片，用 Parafilm 封片，置于潮湿暗盒中 37℃杂交过夜（约 15～17 h）。由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。

四、洗脱

此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。

（1）杂交次日，将标本从 37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。

（2）将已杂交的玻片标本放置于已预热 42～50℃的体积分数 50%甲酰胺/2×SSC 中洗涤3 次，每次 5 min。

（3）在已预热 42～50℃的 1×SSC 中洗涤 3 次，每次 5 min。

（4）在室温下，将玻片标本于 2×SSC 中轻洗一下。

（5）取出玻片，自然干燥。

（6）取 200 μL 复染溶液（PI/antifade 或 DAPI/antifade 染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。

五、杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针）

（1）在玻片的杂交部位加 150 μL 封闭液 I，用保鲜膜覆盖，37℃温育 20min。

（2）去掉保鲜膜，再加 150 μL avidin-FITC 于标本上，用保鲜膜覆盖，37℃继续温育 40 min。

（3）取出标本，将其放入已预热 42～50℃的洗脱液中洗涤 3 次，每次 5 min。

（4）在玻片标本的杂交部位加 150 μL 封闭液 II，覆盖保鲜膜，37℃温育 20 min。

（5）去掉保鲜膜，加 150 μL antiavidin 于标本上，覆盖新的保鲜膜，37℃温育 40 min。

（6）取出标本，将其放入已预热 42～50℃的新洗脱液中，洗涤 3 次，每次 5 min。

（7）重复步骤（1）、（2）、（3），再于 2×SSC 中室温清洗一下。

（8）取出玻片，自然干燥。

（9）取 200 μL PI/antifade 染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。

六、封片

可采用不同类型的封片液。如果封片液中不含有 Mowiol（可使封片液产生自封闭作用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久。

七、荧光显微镜观察FISH结果

先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC 的激发波长为490 nm。细胞被 PI 染成红色，而经 FITC 标记的探针所在的位置发出绿色荧光。

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