内切酶实验的注意事项有哪些？

你知道内切酶实验的注意事项有哪些吗？让我们一起来看看吧！

一、限制性内切酶一般反应条件

当进行限制性酶切反应时，为确保最佳的反应条件，务必要遵守限制性内切酶供应商提供的建议。在此过程中需要考虑的重要参数包括：底物 (DNA) 和酶的量、反应体积以及孵育时间。

根据传统的定义，在最佳反应条件下，一个单位的限制性内切酶可以在1小时内，在50μL体系中 wan全酶切1μL 定义底物（例如，质粒 pUC19）。尽管单位定义提供了一种测定方式，但还需注意，根据 DNA 底物之中的识别序列出现的频率及所用底物类型，针对不同DNA底物使用等量的限制性内切酶可能需要不同的最佳反应条件。实际上，酶供应商往往根据 DNA 样本的潜在质量、数量和性质波动，推荐比wan全酶切所需量多5至20倍的酶（或1μL 酶/反应体积）。

二、星号活性

星号或“松弛"活性是限制性内切酶的一种固有性质，即在非最you反应条件下，限制性内切酶可能会作用于与其天然识别位点存在细微差异的识别序列。例如，如下图所示，EcoRI 可以识别和切割位点5’-GAATTC-3’，但其星号活性可能导致序列在5’-TAATTC-3’和5’-CAATTC-3’处被切割。同样，BamHI 除了可切割其正常的识别序列 5’-GGATCC-3’ 外，还可切割 5’-NGATCC-3’、5’-GPuATCC-3’和 5’-GGNTCC-3’（其中 N 代表任意核苷酸）。

需特别指出，在最佳反应条件下，“星号"位点的切割率要远远低于正常的识别位点（大约相差 105–106）。因此，酶切期间出现星号活性的常见原因为限制性内切酶过量和/或孵育时间过长（过度酶切）。此外，高浓度甘油（例如，>5%）、低浓度盐、非最佳 pH、存在有机溶剂，以及除 Mg2+ 之外的二价阳离子都可能造成底物 DNA 的非特异性切割。使用酶制造商推荐的实验方案和缓冲液，可避免出现星号活性。

三、不wan全酶切

不wan全酶切是在限制性内切酶使用过程中常遇到的问题之一。当酶量过多或过少时，都可能发生不wan全酶切。DNA 样本中存在污染物也可能导致不wan全酶切。缓冲液组分、孵育时间和反应温度等欠佳的反应条件是不wan全酶切的常见原因。

部分限制性内切酶需要辅因子才能实现wan全活性。例如，Esp3I (BsmBI) 需要 DTT，而 Eco57I (AcuI) 需要 S-腺苷甲硫胺酸。AarI 和 BveI (BspMI) 等部分限制性内切酶需要两个拷贝的识别位点才能实现有效切割；针对这一类酶，通常向反应物之中添加一份带有识别位点的寡核苷酸来增强酶活性。

除了反应条件和酶性质外，DNA 自身的性质也会影响限制性酶切。甲基化的 DNA 可耐受部分限制性内切酶的切割（详见甲基化部分）。酶的识别位点过于接近终端（线性底物 DNA 中）以及切割位点相邻（双酶切）都可能影响酶切割 DNA 的效率）。此外，部分超螺旋 DNA 分子要比线性 DNA 分子更难切割，增加 5-10 倍的酶量可有助实现wan全酶切。

四、酶切图谱不正常

即便遵守了制造商的使用说明，仍可能观察到预料之外的底物 DNA 切割结果。为避免陷入此类困境，必须确保酶和 DNA、反应所用的试剂均不含污染物（例如，其它限制性内切酶、DNA 和核酸酶）。

出现预料之外切割的一个原因是，在增殖和扩增过程中，底物 DNA 引入了突变。突变可能破坏已知的识别位点或创造出新的识别位点，从而产生预料之外的酶切结果。对 DNA 进行Sanger 测序，是一种判断突变是否引起底物 DNA 出现预期外切割的有效方法。

有时候预期之外的酶切图谱是由检测过程而非酶切过程造成的。部分限制性内切酶（例如，FokI，TauI）可能会与 DNA 紧密结合，导致电泳时出现明显的凝胶迁移。使用含 SDS 的上样染料，加热使酶从切割的 DNA 上解离开来，均可避免出现这类凝胶迁移现象。

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