影响免疫荧光（IF）实验结果的因素有哪些？

　更新时间：2023-10-08 点击量：654

免疫荧光染色技术是一种以免疫学为基础，结合生物化学技术和显微技术发展而来的蛋白等分子检测技术。那么你知道影响免疫荧光（IF）实验结果的因素有哪些吗？让我们一起来看看吧！

一、免疫荧光染色方法的选择

免疫荧光染色技术分为直接法和间接法。

直接法：将荧光标记物偶联在抗原/抗体上，直接与相应的抗体/抗原反应。

间接法：先用未标记的一抗与抗原充分反应后，再利用荧光标记的二抗与已经结合在抗原上的一抗结合，达到检测抗原的目的。

	优点	缺点
直接法	操作简单、特异性高，非特异性染色少便于相同宿主来源的不同蛋白的共定位	灵敏性相对比间接法低
间接法	灵敏度高，染色更加灵活，成本低。	相对直接法操作复杂

二、抗体的选择

与目标蛋白直接结合的一抗，在条件允许的条件下，尽量选择相同来源的免疫原或者选择已验证种属反应性的抗体。

如果进行不同目标蛋白的双染或多染时，这些不同蛋白所对应的一抗应该来源于不同宿主。

	优点	缺点
单克隆抗体	特异性高	灵敏度相对较低，制备过程复杂，价格也相对较高
多克隆抗体	制备过程简单，周期短，价格相对较低，灵敏度更高，对于表达量较低的目标蛋白更容易检出。	特异性相对较低

单克隆抗体与多克隆抗体、种属免疫原、反应性和抗体的宿主来源是抗体选择最主要考虑的因素，其直接决定着免疫荧光染色的背景、特异性和成败。荧光偶联的二抗应选择与一抗相对应的抗体，及抗一抗的二抗。

三、抗体保存

防止荧光抗体失活、污染以及荧光染料的脱落和淬灭。

在抗体保存过程中，适量分装，避免反复冻融。

蛋白极易被塑料等吸附，如果用塑料管分装，抗体中应添加BSA等。

为防止污染也可以添加0.01%的硫柳汞或者0.1%的die氮化钠。

为防止淬灭，保存荧光抗体时应该注意避光，可以利用锡箔纸包好，或者放在避光的容器中。

四、培养载体的选择

根据贴壁情况，细胞可分为贴壁细胞和悬浮细胞。

贴壁细胞一般常用24孔细胞培养板培养，接种细胞前放置0.17mm玻璃细胞爬片。

悬浮细胞常用6孔板培养，免疫荧光染色处理后，取少量加在0.17mm玻璃细胞爬片上。

最后将细胞爬片倒扣到载玻片上，封片，放4℃保存。

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