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免疫荧光实验流程有哪些?

 更新时间:2023-10-09    点击量:591

免疫荧光是一种常用的光学显微术,即用荧光显微镜来观察细胞中的特定生物分子。免疫荧光依赖于抗体抗原的特异性结合,然后通过直接标记或间接标记方法使用荧光分子指征抗体-抗原结合的位置,以确定目标生物分子在细胞中的位置、丰度和分布情况。那么你知道免疫荧光实验流程有哪些吗?让我们一起来看看吧!

1. 固定

固定液种类:有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮等);交联剂(4%PFA、10%中性福尔马林),固定液的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性。但针对磷酸化的抗体,不适合用甲醛,会导致磷酸蛋白从膜表面转移到胞浆中,故应选择冰冷的无水甲醇或无水乙醇,同时应注意甲醛会挥发,在4-8°C不宜储存太久。

固定时间:取决于组合块的大小和类型,对于大多数组织,18-24h较为理想,细胞固定时间较短,一般2%的甲醛室温固定20min即可。

2. 透化

通透的目的是使抗体进入胞内。0.5% Triton X-100 室温通透20 min(针对胞内抗原,若是细胞膜上表达的抗原则省略该步骤);除了Triton X-100,丙酮也可作为通透剂,并且丙酮固定后的样品不需要通透。

3. 封闭

封闭可减少一抗和二抗与非特异性位点结合。通透后用PBS浸洗玻片3次,每次3 min,吸水纸吸干PBS,在玻片上滴加山羊血清,室温封闭30min。常用的封闭液包括:与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清。从封闭开始所有的步骤,一定要注意样品的保湿,避免样品的干燥,否则极易产生较高的背景。醛类固定的样品,在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封闭液进行封闭。

4. 一抗孵育

根据一抗说明书,按照适当比例用一抗稀释液稀释一抗,用吸水纸吸尽封闭液,每张玻片滴加稀释好的一抗并放入湿盒, 4℃孵育过夜。回收一抗,加入PBST, 在摇床上缓慢摇动洗涤5 min,共洗涤3次。

5. 荧光二抗孵育

用吸水纸吸尽洗涤液后滴加稀释好的荧光二抗,湿盒中孵育1h后,回收二抗,接着用PBST洗3次,每次5 min;由于荧光容易淬灭,故从加荧光二抗起,后面所有操作步骤都要避光。

6. 复染核(定位的关键)

在玻片上滴加DAPI,并注意避光孵育5min,对标本进行染核,然后用PBST洗3次,每次5min,洗去多余的DAPI。

7. 封片

用吸水纸吸干爬片上的液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液封片,然后在荧光显微镜下观察。

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