Trizol法提取RNA的原理与步骤是什么？

RNA 是一种核酸分子，在生物学中扮演着重要的角色。在细胞内，RNA 不仅具有转录和翻译的功能，而且在调控基因表达、细胞信号传导以及病理机制等方面也发挥着重要的作用。Trizol法是目前普遍使用的RNA提取方法，那么Trizol法提取RNA的原理与步骤是什么？让我们一起来看看吧！

一、Trizol法的实验原理

TRIZOL 试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，它在破碎和溶解细胞时能保持 RNA 的完整性。试剂主要成分为异硫氰酸和苯酚，其中异硫氰酸肌可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使 RNA 与蛋白质分离，并将 RNA 释放到济液中。加入氯仿后离心，样品分成水样层(无色)和有机层(黄色)。RNA 存在于水样层中。收集上面的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的 DNA 和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的 DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。

二、Trizol法提取RNA操作步骤

1. 匀浆并裂解样本

组织样本：每10~100mg组织加入1ml TRNsol，建议使用机械匀浆器来匀浆。另外也可 用液氮来破碎组织，用研钵、研杵把组织粉碎后，把粉末转移至一干净的1.5ml小离心管中，在15- 30°C放置5分钟，以che底分离核蛋白复合体。。样本的体积应不超过所使用的TRNsol的体积的10%，否则会出现DNA污染。

2. 相分离

每1 ml TRNsol中加0.2 ml 氯仿。盖上离心管盖子，剧烈地振荡15sec，在冰上孵育5 min。室温 下，12,000×g下离心10min。此时混合物分成三层：底层为苯酚氯仿相层（红色），中间层，和上层水相层（无色）。水相占总TRIZOL的60%，RNAwan全存在于水相中。

3. RNA沉淀

转移不多于80%上层水相至新的离心管中，往水相中加入异丙醇，每使用1ml的TRNsol，加入 500μl的异丙醇(注：如果是含多糖、多酚的植物样品，请加入300μl异丙醇的同时加入300μl 0.8M 柠檬酸钠/1.2M NaCl混合液)。涡旋混匀，室温下放置10min，然后在4度下12,000×g离心10min，离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。糖类丰富的样本：富含多糖的植物样本或富含糖胺聚糖和蛋白质聚糖的动物样本需要使用以下的 修饰的沉淀方法来获得纯的RNA。准备1份Buffer A（1.2M NaCl，0.8M柠檬酸钠）。做完第二步后， 紧接着依次往水相中加入异丙醇和Buffer A （1ml TRNsol加0.3ml的异丙醇和0.3ml的Buffer A）。旋涡混匀，并在室温下,≤12,000×g离心10min，这一高盐沉淀会减少复杂糖类的共同纯化。

4. RNA洗涤

洗涤RNA:弃上清， 并用75%乙醇洗涤沉淀一次。旋涡混和样本，并在室温下以不超过7,500×g 的速度离心样本5min。注意：75％的乙醇必须用DEPC处理过的灭菌水来配制，否则75％乙醇中 残留的RNaseA会降解RNA。5. RNA的溶解:小心地吸弃乙醇，短暂离心将溶滴甩到管底，用移液枪小心吸弃残留的溶液。室 温下空气干燥RNA 5-10min。不要用离心干燥装置或真空干燥装置，因为过度干燥会导致很难用 水重新溶解RNA。加入适当的DEPC水溶解RNA。

5. RNA再溶解

去上清，置真空或空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀，（不能在真空中离心干燥）。注意不能将RNA沉淀wan全干燥，这样会极大地降低它的溶解度。部份溶解的RNA样品其A260/280 ratio < 1.6。

用无RNase 水或0.5% SDS溶液重悬RNA沉淀，用枪头反复吹打几次，静置10分钟，55-60°C。测浓度后-20°C保存。

6. 测浓度

 取2μl 储存液加入另一个EP管中，再加入98μl无RNase水，离心混匀，以无RNase水作空白对照，测OD260/280值。1OD=40μg RNA。OD260/280值在1.8-2.0视为纯度很高。一般浓在1000ng/ml较准。浓度太高要稀释以后再测定。

7. RNA鉴定

甲醛变性琼脂糖电泳，确定抽提RNA完整性和DNA污染情况。

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