离心柱法提取DNA的实验步骤与注意事项有哪些？

离心柱上有硅胶滤膜，在高盐低pH条件下，核酸能结合到硅胶膜上，而蛋白质和其他代谢产物被洗脱；后续改变反应条件到低盐高pH来洗脱纯化DNA。用离心柱法来提取DNA，得到的DNA质量好，纯度和浓度较高。那么离心柱法提取DNA的实验步骤与注意事项有哪些呢？让我们一起来看看吧！

一、实验步骤

1. 平衡液预处理

取一个新的吸附柱放在收集管中，悬空加入100μL的平衡液至离心柱中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将离心柱放回收集管中，备用。

2. 处理材料

（1）如提取材料为血液，可直接使用200μL新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，不足200μL可加缓冲液1补足；

（2）贴壁培养的细胞和动物组织应先处理为细胞悬液，然后10000rpm离心1min，弃上清，加200μL缓冲液，振荡至che底悬浮；

3. 加入蛋白酶K，混匀

（1）提取血液和细胞基因组时，只需加入蛋白酶K混匀，即可继续进行下一步；

（2）提取组织基因组时，加入蛋白酶K混匀，需在56℃放置，直至组织溶解，12000rpm离心30s以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。

4. 加入200μL缓冲液2，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，12000rpm离心30s以去除管盖内壁的水珠。

5. 加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，12000rpm离心30s以去除管盖内壁的水珠。

6. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。

7. 向吸附柱中加入500μL缓冲液3（注意：使用前请确保已加入无水乙醇！），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。

8. 向吸附柱中加入600μL漂洗液（注意：使用前请确保已加入无水乙醇！），离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。

9. 重复操作步骤8。

10. 将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量去除漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，以che底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

11. 将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加50~100μL洗脱液，室温放置3~5min，12000rpm离心2min；将得到的溶液重新放回吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心2min，收集DNA溶液。

12. DNA可以存放在2~8℃，若要长时间存放，可以放置在-20℃。

二、注意事项

1. 所有的离心步骤均在室温完成，均使用台式离心机；

2. 使用前确保缓冲液3和漂洗液中预先加入无水乙醇；

3. 实验前将需要的水浴先预热到70℃备用；

4. 第10步，要让漂洗液挥发干净，否则会影响后续的实验；

5. 样品需要避免反复冻融，否则会影响DNA的得率。

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