ELISA实验结果异常的因素有哪些？

ELISA运用了免疫学原理和化学反应显色原理，需要将抗原或抗体预包被在固相载体表面，使后来形成的抗原-抗体-酶（荧光基团）-底物复合物黏附在载体上，通过检测OD值或发光值，来检测靶蛋白的含量。ELISA适合用于定量检测胞外的分泌性蛋白，检测大分子抗原和特异性抗体等。那么ELISA实验结果异常的因素有哪些呢？让我们一起来看看吧！

一、样品

样品是检测的前提，样品质量会直接影响实验结果。可以用ELISA来检测的样品很多，根据检测项目不同可以是血清、血浆、唾液、尿液等，但大部分还是以血清为样品。作为血清样品，应避免溶血，溶血可能会增加非特异性显色，导致结果出现误差。

血清样品的反复冻融会使血清中的抗体效价下降，所以需要多次检测的血清样品，如在5d内检测完，可4℃保存，如需长时间检测，可进行分装冻存。样品如被细菌污染腐败，可能会导致假阳性。

二、温度

温度主要影响抗原抗体反应，酶促反应速度及非特异性吸附，温度升高可使抗原抗体结合反应加速，但也易引起抗原抗体复合物的解离。酶促反应速度同样随温度升高而增快，但是酶蛋白变性也加快，丧失酶学活性，降低酶的有效浓度而减慢反应速度，温度低时以前者为主，高时以后者为主。

温度是质量控制的一个重要方面，一般允许±1℃的误差。最好水浴，微孔板浮在水面，使温度迅速平衡。如放温箱内温育，微孔板不应叠置，为避免蒸发，板上应加盖，盛放微孔板的湿盒应是金属的，传热容易。空湿盒应预先放在温箱中，以平衡温度，在室温较低时更需要。

三、时间

在温度保证的前提下，时间的控制至关重要，尤其是底物显色的时间控制，显色时间不足或过长会导致实验不成立，无法对检测结果进行判断。

加人标本、试剂及混合的时间称为操作时差。操作时差在每个试验中都存在，对结果或多或少有影响。对手工操作，尤其是样品量大的项目，从加人第一个标本到最后一个标本，需几十分钟，加人试剂及混匀存在很大的时间差异，使抗原抗体和酶促反应时间不一致，易产生假阳性、假阴性结果。

因此，样品过多时，请选择分批操作，对勿须更换移液口吸嘴的酶结合物，底物的加样可选择8联或12联专用的多道加液器。亦可避免单孔滴加底物时遗漏多加。

四、设备

仪器设备是ELISA实验的基础，常用的相关仪器设备包括移液器、酶标仪、洗板机和恒温箱等。所有设备都需要进行检验校准，保证准确性和精确度。

移液器的使用要尽可能选择所需加液量接近最大量程，并正确使用，减少实验误差。

酶标仪要提前开机预热，保证光源稳定；洗板机要检查加液孔是否通畅，保证加液量。

恒温箱要提前开机，开、关门要快速，保证反应温度。

五、显色

显色是ELISA中的最后一步反应,此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内,阴性孔可保持无色,而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。

在定量测定中,加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行,时间一般不需要严格控制,有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短或延。

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