支原体污染的检测方法有哪些？

支原体污染一般在显微镜下不可见，很难察觉，但细胞会受到极大的损伤，主要通过以下途径影响细胞生长及功能。那么支原体污染的检测方法有哪些呢？让我们一起来看看吧！

一、分离培养法

检测方法：将待检样品接种到适合支原体生长的液体培养基或固体培养基中，如有支原体污染，液体培养基颜色会改变，固体培养基将会有菌落生长。

优点：该方法被称为支原体培养法的金标准，可以检测绝大多数支原体。

缺点：支原体生长到一定数量才能判断是否有污染，检测时间长，无法实现对支原体的快速检测

二、原位染色法

检测方法：通过染色试剂（如DAPI、Hoechst 等）对待测细胞培养物进行染色，在荧光显微镜下观察待测样品的荧光判断支原体污染。

优点：可清晰直观的看到支原体微粒。

缺点：死亡细胞释放的DNA也会被染色，在支原体轻度污染时，较难判断是否有支原体污染。

三、化学发光法

检测方法：利用支原体te有酶的活性并通过ATP依赖的萤光素酶催化的发光反应进行检测，通过比较检测试剂加入前后ATP量的变化来确定样品是否有支原体污染。

优点：检测快速，仅需15min即可完成检测。

缺点：该方法只能检测活的支原体，如果支原体死亡，将无法通过ATP的变化判断支原体污染。

四、探针法qPCR

检测方法：设计特异性引物和荧光探针，通过探针法qPCR高灵敏检测培养的细胞等生物材料中是否有支原体污染。

优点：灵敏度高，检测快速，可一次性检测大量样品，PCR扩增后无需电泳分析即可判断是否具有支原体污染。

缺点：该方法灵敏度很高，因此对实验环境要求较为苛刻，且需要精密的qPCR仪器。

五、等温扩增变色法

检测方法：通过设计4-6对特异性引物，在一定的恒定温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物进行核酸的快速扩增，并且通过颜色变化而无需电泳分析即可确定是否有支原体污染。

优点：不需要反复的升温和降温，不需要精密的仪器，在恒定的温度下即可对核酸进行扩增。反应结束后，无需电泳分析，通过颜色变化即可判断是否具有支原体污染。

缺点：对引物要求较高，需要设计多对引物，且扩增产物不能用于测序。

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