PCR技术的基本原理、各步骤的目的是什么？

你知道PCR技术的基本原理、各步骤的目的是什么吗？让我们一起来看看吧！

一、PCR技术基本原理

PCR是一种选择性体外快速扩增DNA片段的方法。在体外以类似于细胞内DNA的半保留复制过程，以拟扩增的模板DNA分子，与模板DNA互补的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4种dNTP及适合的缓冲体系组成的反应体系，经过重复地变性一退火一延伸三步，扩增新的目的DNA链，这个过程通过控制反应体系的温度来实现。

PCR包含下列三步反应：

1、变性(denaturation)

将反应体系混合物经加热至94℃左右，维持较短的时间，使双链DNA变成单链DNA，便于下一步引物的结合。

2、退火(annealing)

将反应体系温度下降到特定温度（一般是引物的Tm值以下)，引物与DNA模板以碱基互补的方式结合，形成模板-引物杂交双链。退火温度是保证引物与DNA模板互补结合的关键。由于引物结构简单，加之引物量远远大于模板DNA的数量，所以DNA模板单链之间的互补结合很少。

3、延伸(elongation)

将反应体系的温度上升到72℃左右并维持一段时间，在Taq DNA聚合酶的作用下，以引物为起始点，以4种单核苷酸（dNTP）为底物，从5'→3'方向延伸反应，合成新的DNA双链。

以上三步反应为一个循环，重复进行变性、退火、延伸这三步反应，如此反复循环可以使DNA以指数形式进行扩增。上述过程1.5小时左右完成，从而使所需的目的DNA片段扩增放大百万倍。

二、PCR各步骤目的

1、预变性

破坏DNA中可能存在较难破坏的二级结构。使DNA充分变性，减少DNA复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好地和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要省去这个步骤。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。

2、变性一退火一延伸循环

(1)模板DNA的变性

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双徒DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备。

(2)模板DNA与引物的退火（复性）

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

(3)引物的延伸

DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

3、PCR仪扩增循环后72℃延伸10分钟

用PCR仪扩增时，变性一退火一延伸循环完成后，继续72℃延伸10分钟的原因是：

(1)在反应体系一定的条件下，延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。例如，使用Taq DNA聚合酶，72℃时的碱基掺入率为35~100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。

(2)根据延伸速率推得，扩增1kb以内的DNA片段1分钟即可，而3~4kb则需要3~4分钟，依次类推。通常，在最后一轮要适当地将延伸时间延长至4~10分钟，这样做是使PCR反应wan全以提高扩增产量。

(3)继续72℃延伸10分钟除了可以使PCR反应wan全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通Taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。

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