PCR反应体系主要是什么？

你知道PCR反应体系主要包含那些吗？让我们一起来看看吧！

一、模板（template)

模板即扩增用的DNA，可以是任何来源DNA(如基因组DNA、质粒DNA等)或RNA（如总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA等），但必须符合两个条件：一是纯度必须较高，二是浓度不能太高以免抑制。模板是待扩增的目的基因或特异片段，如诊断病人是否携带有突变基因时，其模板就是提取的病人血液中的DNA或RNA片段。PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。

二、引物（primers)

人工合成的一对引物可以分别与两条模板DNA互补结合的寡核苷酸序列，其中一条称为上游引物，另一条称为下游引物。引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。引物浓度一般为0.1~0.5umol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般为15~30bp,引物过长或过短都会降低特异性。其3'末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G(因T错配也能引发链的延伸)。引物GC占45%~55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。

三、底物(dNTP)

dNTP包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1mol/L NaOH或1mol/L Tris-HCl的缓冲液将其pH调节至7.0~7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。一般存储浓度为10mo/L，各成分以等当量配制，反应终浓度为20~200umol/L，如其中任何一种浓度不同于其他几种时（偏高或偏低），就会引起错配。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。多次冻融会使dNTP降解。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。当PCR需要较高浓度的dNTP时，应在反应体系中适当增加Mg2+的浓度。

四、DNA聚合酶

PCR所用的酶主要有Taq和Pfu两种来源，分别来自两种不同的噬热菌。其中，Taq扩增效率高但易发生错配：Pfu扩增效率弱但有纠错功能。所以，实际使用时必须根据需要做不同的选择。目前使用最多的是Taq酶。该酶在92.5℃、95.0℃和97.5℃时，其半衰期分别为130分钟、40分钟和5~6分钟，可见该酶具有良好的热稳定性。Taq酶还具有良好的延伸效率，其生物学活性在75~80℃时最高，一般用72℃，每一个酶蛋白分子每秒可延伸约150个核苷酸。在70℃时，延伸速率为60个核苷酸/秒以上。当温度超过80℃时，该酶延伸速率明显下降，可能与引物—模板遭到破坏有关。其最适pH值为8.3~8.5，能催化以DNA单链为模板、以碱基互补原则为基础、按5'→3'方向逐个将dNTP分子连接到引物的3'端、合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链，无3'→5'的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP或Mg2+浓度过高，会增加其错配率。用量一般为0.5~5.0个单位/100uL。

五、PCR缓冲液(PCR buffer)

缓冲液的成分最为复杂，除水外一般包括四种有效成分：①缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；②一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；③二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；④辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA接触缠绕结构。

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