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022-66387942蛋白表达实验的时,有时候实验会觉得参考实验方法和克隆的蛋白基因序列wan全没有问题,但蛋白电泳就是没有结果。下面让我们一起来看看蛋白表达的常见问题有哪些吧!
1、载体构建错误,很多克隆新人经常弄错读码框。比如Qiagen的pQE系列载体,其克隆位点常有一两个碱基的区别;另外有些酶产生粘端有些酶产生平端,这些都容易导致读码框错误,从而表达不出来。
2、宿主菌选择不当,不同的宿主菌其基因型是不一样的。有些经过特殊修饰的载体,或者特殊用途的载体,或者有特殊启动子的载体,必须选择合适的宿主菌进行表达。因此,当你的蛋白没有表达出来时,可以考虑更换宿主菌。
3、密码子的使用频率低。有些基因其本身含有许多稀有密码子,尤其是起始密码之后的15个碱基之内的稀有密码子,对蛋白表达有着很重要的影响。优化密码子对原核表达似乎效果很好,对真核表达系统未见得有很好的效果。
4、质粒不稳定或者质粒丢失。pET系统通常比较稳定。但是你选用带氨苄青霉素抗性的载体时,也许有可能产生β-lactamase降解了抗生素,使质粒丢失。还有一种情况是表达重组的毒素蛋白,对宿主细胞也有毒性,造成质粒丢失。这种情况多见于真核表达系统。
5、蛋白酶将蛋白降解了。这种情况常由重组蛋白本身的N-或C-端序列引起的。当蛋白N-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或 Tyr这些氨基酸时,容易遭受蛋白酶降解,此即N-末端规则。N-端是Met时,大肠杆菌可以悄悄地把这个Met偷走,特别是Met后紧跟着一个带小侧链的氨基酸时。C-末端存在非极性氨基酸时,也容易导致蛋白被降解。C末端最后5个氨基酸是极性的或者带电荷的,则不易被降解。
6、二级翻译起始位点。这种情况见于你的序列里正好含有和核糖体结合位点wan全一致的序列。那就怪不得人家了,核糖体会很高兴地找到这个位点,然后开始翻译,致使你的蛋白被截短,在电泳时看不到预期大小的片段。
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