荧光原位杂交（FISH）的实验步骤是什么？

荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是 20 世纪 80 年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。那么你知道荧光原位杂交（FISH）的实验步骤是什么吗？让我们一起来看看吧！

一、实验材料准备

1. 实验用具及材料

（1）人的 MyoD1（MYF3)基因探、人外周血中期染色体细胞标本；

（2）指甲油、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温 20 等；

（3）恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、Nikon E-400 荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200μL移液器、暗盒等。

二、实验方法及步骤

1. 探针变性

将探针在 75℃恒温水浴中温育 5 min，立即置 0℃，5～10 min，使双链 DNA 探针变性。

2. 标本变性

（1）将制备好的染色体玻片标本于 50℃培养箱中烤片 2～3 h。（经 Giemsa 染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。

（2）取出玻片标本，将其浸在 70～75℃的体积分数 70% 甲酰胺/2×SSC 的变性液中变性2～3 min。

（3）立即按顺序将标本经体积分数 70%、体积分数 90%和体积分数 100%冰乙醇系列脱水，每次 5 min，然后空气干燥。

3. 杂交

将已变性或预退火的 DNA 探针 10 μL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上 18×18 盖玻片，用 Parafilm 封片，置于潮湿暗盒中 37℃杂交过夜（约 15～17 h）。由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。

4. 洗脱

此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。

（1） 杂交次日，将标本从 37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。

（2） 将已杂交的玻片标本放置于已预热 42～50℃的体积分数 50%甲酰胺/2×SSC 中洗涤3 次，每次 5 min。

（3） 在已预热 42～50℃的 1×SSC 中洗涤 3 次，每次 5 min。

（4） 在室温下，将玻片标本于 2×SSC 中轻洗一下。

（5） 取出玻片，自然干燥。

（6） 取 200 μL 复染溶液（PI/antifade 或 DAPI/antifade 染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。

5. 杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针）

（1） 在玻片的杂交部位加 150 μL 封闭液 I，用保鲜膜覆盖，37℃温育 20min。

（2） 去掉保鲜膜，再加 150 μL avidin-FITC 于标本上，用保鲜膜覆盖，37℃继续温育 40 min。

（3） 取出标本，将其放入已预热 42～50℃的洗脱液中洗涤 3 次，每次 5 min。

（4） 在玻片标本的杂交部位加 150 μL 封闭液 II，覆盖保鲜膜，37℃温育 20 min。

（5） 去掉保鲜膜，加 150 μL antiavidin 于标本上，覆盖新的保鲜膜，37℃温育 40 min。

（6） 取出标本，将其放入已预热 42～50℃的新洗脱液中，洗涤 3 次，每次 5 min。

（7） 重复步骤（1）、（2）、（3），再于 2×SSC 中室温清洗一下。

（8） 取出玻片，自然干燥。

（9） 取 200 μL PI/antifade 染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。

6. 封片

可采用不同类型的封片液。如果封片液中不含有 Mowiol（可使封片液产生自封闭作用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久。

7. 荧光显微镜观察 FISH 结果

先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC 的激发波长为490 nm。细胞被 PI 染成红色，而经 FITC 标记的探针所在的位置发出绿色荧光。

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