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022-66387942WB实验是分子生物学中最为常见的实验,那么你知道影响WB实验的因素有什么吗?让我们一起来看看吧!
一、蛋白样本制备
1. 蛋白质的样品制备注意以下问题:
(1)在合适的条件下,保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
(2)选择合适的表面活性剂和还原剂,使其形成各自多肽的溶液。
(3)尽量去除核酸,多糖,脂类等分子的干扰,裂解完毕离心之后取中层澄清溶液时避免吸到底层沉淀和上层脂类。
(4)整个制作蛋白样本的制备过程必须在低温下进行,避免细胞破碎释放出各种酶类,但是注意不要反复冻融。
(5)所抽取样品的蛋白含量,蛋白变性是否充分等等,还有,蛋白样品的pH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外,蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。
2. 小分子量蛋白10KD需要的注意点
(1)可选择孔径0.22μm的PVDF膜或者NC膜,转膜时间缩短,另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系;
(2)也可以选择PSQ膜,同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起,再转移,其他按步骤即可。
3. 大分子量蛋白200KD需要的注意点:
(1)做200kd蛋白的WB时要注意,分离胶最好选择>7%的;剥胶时要小心;
(2)转移时间需要相应延长;要做分子量参照(否则出现杂带不知道如何分析);
(3)转膜液中甲醇含量可适当降低,推荐使用湿装转膜效率更高。
二、凝胶的配制
制胶关键是聚合时间,分离胶聚合控制在从加入10%AP和TEMED至开始凝胶,时间为10—20分钟(未wan全凝聚),浓缩胶最佳聚合时间为8-10min,可通过控制AP和TEMED量来控制。
1. 凝胶质量
不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高,分离胶的pH值应在8.8左右,而浓缩胶的pH应在6.8左右,最好不要差过0.5个pH单位,因为这个pH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件,也是保证能充分压缩样品的前提。
因此,制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液的pH值是否稳定是很重要的。
2. 在用ddH2O压分离胶的时候为什么经常存在中间凸的现象?
(1)加水时不能对着胶冲,要沿着玻璃板缓慢流行;
(2)加水满后一定要保证上方水平面是平齐的;
(3)加胶要避免气泡,也要避免加胶太慢而提前凝固等现象;
三、电泳
1. 应待凝胶充分凝固后电泳,或者催化剂加入后充分混匀,否则条带容易中间凹陷两边翘起。
2. 两板玻璃之间排除所有的气泡,防止条带中间鼓两边下陷。
3. 加样前离心,选择适当的样本缓冲液(尽量用新鲜配制的,这样能保证pH值和离子强度的稳定),加适量的样品促溶剂,防止wb条带拖尾或蛋白出现纹理。
4. 常用浓缩时80V,分离时100V比较好,条带很平。
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