RNA提取准备工作及注意事项有什么？

你知道RNA提取准备工作及注意事项都有什么吗？让我们一起来看看吧！

一、枪头和EP管等的消毒灭菌

1. 用去离子水配制0.1%（千分之一）的DEPC（剧毒物），须在通风橱中小心使用，避光密闭4℃保存;

DEPC水是用DEPC处理过并经高温高压消毒的纯水。经检测不含RNase、DNase和proteinase。

2. 将枪头和EP管放入0.1%的DEPC内，保证枪头和EP管内都充满0.1%的DEP。

3. 避光、静置、过夜（12-24h）

4. 装枪头和EP管的盒子不需要用DEPC浸泡，将枪头或者EP管内的DEPC水大致去除干后，装起，包好

5. 121摄氏度，30min

6. 180摄氏度，干燥数个钟头（至少3小时以上）

注意：a、处理DEPC时需要戴乳胶手套、口罩！b、或者不用DEPC消毒，130℃，90min高压灭菌（许多实验室高温灭菌两次）

RNA提取注意事项

二、组织 RNA 抽提失败的现象

RNA降解和组织内杂质的残留，关于降解问题，首先看一下为什么从培养细胞中抽提RNA不容易降解。现有的RNA抽提试剂，都含有快速抑制Rnase的成分。在培养细胞中加入裂解液，简单的混匀，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻di裂解。细胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的Rnase，所以RNA得以保持完整。也就是说，培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触，所以其RNA不容易被降解；反过来讲，组织中的RNA之所以容易被降解，是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致。因此，假定有一种办法，在抑制RNA活性的同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就可以彻di解决了。

液氮碾磨就是zui有效的这样一种办法。但是，液氮碾磨方法非常麻烦，如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。这样就产生了退而求其次的方法：匀浆器。匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制Rnase活性这个问题，而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的Rnase降解RN 的速度快

电动匀浆器效果较好，玻璃匀浆器效果较差，但总的来说，匀浆器方法是不能杜绝降解现象的。因此，如果抽提出现降解，原来用电动匀浆器的，改用液氮碾磨；原来用玻璃匀浆器的，改用电动匀浆器或者直接用液氮碾磨，问题几乎 100% 能获得解决。

三、样品的收集/保存

影响降解的因素样品离开活体/或者原来的生长环境后，样品中的内源酶即会开始降解 RNA，降解速度与内源酶含量及温度有关。传统上，只有两个办法可以彻di抑制内源酶活性：立即加入裂解液并且彻di而迅速地匀浆；切成小块后立即投入液氮冷冻。这两个办法都要求操作快速。后者适合所有的样品，而前者只适合细胞及内源酶含量较低的并且较容易匀浆的组织。具体地讲，植物组织，肝脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等最好都先用液氮冷冻起来，再往下做。

四、裂解液的选择

影响操作方便程度，内源杂质残留的因素常用的裂解液几乎都能抑制Rnase活性，因此，选择裂解液的重点是要结合纯化方法一起考虑。只有一个例外：高内源酶含量的样品建议使用含苯酚的裂解液，以增加灭活内源酶的能力。

五、纯化方法的选择

影响内源杂质残留，抽提速度的因素对于干净的样品，如细胞，手边的几乎任何纯化方法都可以获得满意的结果。但对于许多其它样品，尤其是植物，肝脏，细菌等杂质含量很高的样品，选择合适的纯化方法是至关重要的。柱离心式纯化方法抽提速度快，能有效去除影响RNA后续酶反应的杂质，但价格较贵；使用经济而经典的纯化方法，如LiCl沉淀等，也可以获得满意的结果，但操作时间长。

六、RNase污染的来源

1. 手指，手指头是外源酶的第一来源，所以必需戴手套并且频繁更换。另外，口罩也必需戴，因为呼吸也是一个重要的酶来源。戴手套口罩的另外的好处是保护实验人员。

2. 枪头，离心管，移液器 – 单纯的灭菌是不能灭活Rnase的，所以枪头和离心管要用DEPC处理，即使是标明为DEPC处理过的。移液器最好是专用的，用前用75%的酒精棉球搽拭干净，尤其是杆子；另外，一定不要使用褪头器。

3. 水/缓冲液一定要确保无Rnase污染。

4. 实验台面最起码要用75%的酒精棉球搽拭干净。

5. 内源Rnase所有组织均含内源酶，故组织用液氮速冻是降低降解的最好办法。液氮保存/碾磨方法的确不方便，但对有一些内源酶含量很高的组织，却是唯yi的办法。

6. RNA样品RNA抽提产物可能都会含痕量的Rnase污染。

7. 质粒抽提质粒抽提往往用到Rnase降解RNA，残留的Rnase要用 Proteinase K消化，PCI 抽提。

8. RNA保存即使低温保存，痕量的Rnase亦会导致RNA降解。长期保存RNA 的最好办法是盐/醇悬液，因为醇在低温时抑制所有的酶活性。

9. 阳离子（Ca、Mg）在含这些离子时，80C加热5分钟会导致RNA被剪切，故如果RNA需要被加热，保存液需要含螯合剂（1mM Sodium Citrate， pH 6.4）。

10. 后续实验所用的酶酶均有可能被Rnase污染。

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