研究蛋白质相互作用的方法有哪些？

相当多的蛋白质行使功能的时候并不是单打独斗的，蛋白质们通过蛋白质相互作用形成复合体然后进行工作。因此，研究蛋白质的相互作用成为研究蛋白质功能和作用机制的最为重要的环节之一。那么你知道研究蛋白质相互作用的方法有哪些吗？让我们一起来看看吧！

一、酵母双杂交系统

原理：很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain, BD）与转录激活域（Transcriptional activationdomain, AD）。这两个结构域各具功能，互不影响，但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成激活功能。

将两待测研究蛋白（蛋白X与蛋白Y）分别与BD、AD结构域构建融合质粒。将构建好的两个质粒转入同一酵母细胞中表达，如果两蛋白之间不存在相互作用，则下游基因（报告基因）不会转录表达；如果两个蛋白存在相互作用，则BD与AD两结构域空间上很接近，从而下游基因（报告基因）得到转录。判断通过报告基因表达与否，即可判断两蛋白之间是否存在相互作用。

用酵母双杂交系统能够快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用，并能寻找、分离与已知蛋白相互作用的配体，在研究抗原和抗体相互作用、发现新的蛋白质和发现蛋白质的新功能、筛选药物作用位点及药物对蛋白互作影响、建立基因组蛋白连锁图等方面应用广泛。

二、免疫共沉淀

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一种以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究两个蛋白相互作用的经典方法。

原理：基于抗体与抗原（靶蛋白）之间的特异性结合，此时如果样品溶液中存在能与靶蛋白相互作用的目的蛋白，会一同被拉下来，随后利用SDS-PAGE，Western Blot等方法对得到的目标蛋白进行分析，进而证明两者间的相互作用。

三、免疫荧光共定位

将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。一般用来验证2种或3种蛋白是否存在共定位关系。

由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。两种不同的蛋白使用不同属性的不同颜色荧光标记后，通过观察颜色的变化确定是否有共定位，也可以使用软件进行分析。

该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完quan解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。

四、Pull-down实验

Pull-down实验，又称拉下实验，是一种体外亲和纯化技术。（这个实验跟免疫共沉淀实验很像，不同的是免疫共沉淀是在细胞里进行的。）

原理：将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），但细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质"则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。

为了更有效地利用pull down技术，可以将待纯化的蛋白以融合蛋白的形式表达，即将“诱饵"蛋白与一种易于纯化的配体蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。

五、双分子荧光互补技术

双分子荧光互补（Bimolecular fluorescence complementation, BiFC），该技术是利用荧光蛋白的特点来研究蛋白的相互作用。

荧光蛋白可从特定的位点被分开，产生两个非荧光活性片段即N端片段（N-fragment）和C端片段（C-fragment）（VN及VC）。当两片段分别被融合到相互作用的蛋白上时，会因蛋白的相互作用力而被拉近、发生互补从而重新构建成有活性的荧光蛋白并在激发光下产生荧光。因此利用荧光显微镜就可以直接通过观察荧光有无来判断蛋白是否发生相互作用。

这是在活细胞中观察蛋白相互作用的很好的方法。

这个方法还是存在假阳性的，细胞里大量表达的分段的黄色荧光蛋白（YFP）可能会不受研究蛋白的结合与否而自己结合在一起，所以阴性对照的使用非常重要。

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