质粒转染的操作步骤

　　质粒转染的操作步骤
 

　　转染(transfection)是细胞在一定条件下主动或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。质粒转染对于哺乳细胞蛋白的表达至关重要，转染的方法和步骤直接影响着转染的成功与否。那么你知道质粒转染的操作步骤有那些吗？让我们一起来看看吧！
 

　　以24孔板培养的哺乳动物细胞为例：
 

　　一、种细胞；
 

　　1. 贴壁细胞：转染前一天每孔0.5-2×10E5个细胞接种于500ul培养基中，在转染时细胞可长至90-95%汇合度。
 

　　2. 悬浮细胞：在配置转染液前每孔4-8×10E5个细胞接种于500ul培养基中。
 

　　二、转染液配置，每孔细胞用量如下：
 

　　1. 用50ul无血清培养基稀释质粒DNA，轻轻混匀。
 

　　2. 取适量合适的质粒转染试剂在50ul无血清培养基中稀释，室温孵育5min。
 

　　3. 将前两步所稀释的DNA和质粒转染试剂混合，轻轻混匀，室温放置30min。
 

　　三、在每孔细胞中加入混合后的转染液，轻轻摇匀。
 

　　四、贴壁细胞可在转染4-6h后更换培养基，悬浮细胞可在转染后18-48h间进行细胞换液，转染18-48h后可检测基因mRNA水平表达。如果检测蛋白表达，需在转染后48-72h收集细胞样品。
 

　　五、对于稳定转染，在转染24h后以1:10传代培养，第二天可加入选择培养基。
 

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