PCR到底是什么？

PCR技术问世已有30多年，期间创新性生物技术不断涌现，然而PCR技术的地位依然不可撼动，PCR的全称是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），简单说来，PCR技术是利用DNA双链复制的原理，在生物体外大量扩增特定DNA片段的技术，PCR作为一项bi不可少的技术手段，仍被广泛应用在基因克隆、基因表达分析、病原体检测、疾病诊断、基因测序、生物制药、基因/细胞治疗、分子育种、物种鉴定、法医鉴定等各个领域。

标准的PCR过程包括三个步骤：变性(Denaturation)——退火(Annealing)——延伸(Extension)。

一、变性

变性是通过高温（通常为90～95℃）破坏双链DNA的氢键，使其变成单链DNA。变性的时间和温度会根据DNA片段的复杂程度、GC含量、大小以及缓冲液的盐浓度来确定。

二、退火

退火是指在DNA形成单链之后，通过降低温度，使引物能够结合到单链DNA的目标区域上。一般情况下，引物完成退火所需的孵育时间为0.5-2分钟。通过计算PCR扩增引物的熔解温度（Tm），可以确定适当的退火温度，通常比引物的Tm低3-5℃。

三、延伸

指DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，目标序列为模板，按照碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的链。

在延伸阶段，DNA模板与引物结合物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，在模板的指导下，按照碱基互补配对和半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的链。一般将温度设定在70-75℃之间，因为热稳定性DNA聚合酶在这个温度下活性最佳。延伸的时间取决于DNA聚合酶的合成速度和目标DNA的长度。当目标片段的扩增长度较长（如大于10 kb）时，除了需要增加延伸时间，还需降低温度，以确保引物能在长时间循环中保持酶的活性。另外，假如引物退火温度与延伸温度相差未超过3℃，则退火和延伸温度可合并成一步，称为两步PCR法，可取代传统的三步PCR法。两步PCR法无需在退火和延伸之间转换和稳定温度，从而缩短了PCR所需的时间。通过重复变性——退火——延伸这三个过程，即可获得更多的“半保留复制链"，而这种新链又能作为下个循环的模板，不断循环。

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