质粒构建的过程有哪些？

    质粒构建是分子生物学研究中zui常用的实验技术，原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。那么你知道质粒构建的过程有哪些吗？让我们一起来看看吧！

一、质粒载体制备

    质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切，一般推荐使用双酶切。其实目的就只有一个，尽量使载体的末端具有特异性，防止自连。

1）选择质粒上两个酶切位点的距离不应小于太小（>10bp），否则影响限制性内切酶对切点的识别，不利于空载体的双酶切。

2）一般目的基因用于克隆表达的情况下，酶切位点的选择要考虑到：目的基因片段内部不含有所选的酶切位点（不然鉴定阳性重组子双酶切时会将目的基因切断）。

3）实验后继应用的所有载体（真核、原核、酵母、昆虫）都尽可能含有所选的酶切位点。并且要保证在载体上的插入方向正确（定向克隆）。（不然换载体表达时，还要重新设计引物，以引进新的酶切位点）。

4）尽可能选比较常用的酶切位点（常用切点酶的价格比较便宜）。

5）两个酶切点至少隔上3个碱基。

6）两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。

7）最好使用酶切效率高的酶。

8）最好使用双酶切有共同buffer的酶。

二、目的片段制备

    主要使用PCR扩增的手段，首先要对目标片段进行扩增富集。PCR 即聚合酶链式反应，它是一种用于扩增复制特定 DNA 片段的常用分子生物学技术。PCR 的最大特点是能将微量的 DNA 大幅扩增，在克隆前获得大量的目标基因片段。

    利用引物设计软件如 Primer 5 或 NCBI Primer-BLAST 在线设计引物并合成后，配制 PCR 反应体系：将模板、引物、dNTP、酶、反应缓冲液和 ddH₂O 按比例加入，加好后轻微点离，放入 PCR 仪中扩增目的片段，扩增后通过琼脂糖凝胶检测目的片段大小是否正确。

三、酶切连接

    获得目标片段后，要与我们的质粒载体进行连接，必须借助两个工具来实现——酶切工具（限制性内切酶）和连接工具（DNA 连接酶），这里使用的内切酶在我们的片段和载体上产生的接口一定要相同，不然DNA连接酶是无法将它们连接上的。

四、转化鉴定

    将连接产物加入感受态细胞（常见的感受态细胞：DH5α、BL21，他们可是转运过程的小能手，负责质粒的克隆和表达，这里下期科普百科会详细介绍），冰上放置30min、42°C 热激转化或电转化，加入无抗性 LB 培养基，200rpm -37°C 摇床摇 45-60min 后，涂至抗性或者其他筛选平板上，37°C 培养过夜、挑取 3-5 单个克隆摇菌、菌落 PCR 或提取质粒后酶切鉴定、鉴定完毕后送质粒或菌液测序验证。

更多有关质粒构建的过程，请联系天津益元利康生物科技有限公司。