双荧光素酶实验的注意事项有哪些？

双萤光素酶报告基因通常以萤火虫萤光素酶为报告基因，以海肾萤光素酶为内参基因，如此所构成的报告系统有检测灵敏度高、动态范围广、内参平衡等优势，因此在实验中得到广泛应用。那么你知道双荧光素酶实验的注意事项有哪些吗？让我们一起来看看吧！

一、荧光值过高

荧光值过高可能会超出仪器检测范围，从而检测不到值，一般读数在5-6位之间较好。荧光值过高可通过以下方式尝试解决：

1.减少质粒转染量；

2.细胞样品裂解后，离心取上清后检测或对裂解产物进行稀释后检测。

（注：不建议通过减少底物量来降低荧光值，需要保证底物的饱和来反映荧光素酶真实的表达水平，否则会造成检测结果出现大的偏差。）

二、荧光值过低或无荧光值

1. 启动子活性低

a.优化细胞的培养条件，提高荧光素酶的表达量；

b.更换强启动子（如SV40、CMV）。

2. 转染效率低

a.优化转染实验条件，用较易转染的质粒做阳性对照（如转染过表达荧光蛋白质粒）；

b.确保转染DNA的质量，可通过酶切或琼脂糖凝胶电泳的方法对DNA质量进行鉴定；

c.选择活性较高，处于指数分裂期的细胞进行转染。

3. 样品裂解效率低

a.细胞培养时间不宜过长，12-36h内最好，长时间培养后，细胞可能会难裂解；

b.加入的裂解液需足量，保证细胞能够充分裂解。

4. 荧光信号衰减

荧光素酶的半衰期一般约30min，加完底物后可立即检测，尽量在30min内完成。

5. 底物氧化失效

a.底物避光密封保存，萤火虫荧光素酶底物-20℃保存；海肾荧光素酶底物推荐-80℃保存；

b. 反应工作液建议现用现配。

三、如何判断转染成功

1. 如转入的miRNA带荧光标记如GFP，则可直接在转染后、细胞裂解前，显微镜下观察细胞荧光；

2. 如转入的miRNA不带任何荧光标记，可考虑进行miRNA的qRT-PCR检测，通过检测结果判断实验组2、4、6是否相对其对照组miRNA有显著过表达；

3.设置一个荧光质粒转染参照组，同批转染一个组的细胞，间接反映出同批次实验的转染情况。

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