细胞传代培养的常见问题有哪些？

细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。那么你知道细胞传代培养的常见问题有哪些吗？让我们一起来看看吧！

一、细胞何时进行传代

通常当细胞生长至wan全汇合进行传代，避免细胞生长过密，对于特殊情况，比如有接触抑制的细胞，一般在密度70-80%就进行传代，避免引起细胞分化。

二、贴壁细胞胰酶消化如何控制时间

贴壁细胞培养一个关键步骤胰酶消化，消化过度会导致细胞碎片增多，细胞成片脱落，严重影响细胞活性，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失，消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打造成细胞损伤，活性下降。

一般浓度在0.25-0.5%。作用时间根据细胞种类、作用温度等因素而变化很大，从几分钟到几十分钟不等。0.25%的胰酶作用于单层贴壁的细胞，在37度条件下，一般消化1-5分钟就足够了。终止是用血清。主要对于新购买的细胞，可以先用低浓度的胰酶去摸索一下消化时间，可每隔1分钟镜下观察细胞是否变圆，记录最佳消化时间，下一次操作参考之前的记录来控制时间即可。

三、如何看活细胞

可通过显微镜观察：活细胞中间透亮，饱满，有光泽，死细胞较暗。或通过台盼蓝染色来计算细胞活力，活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。有细胞计数仪的，可直接用计数仪计数。

四、细胞传几代开始死亡或细胞存活率不佳，增值变慢

可能是培养基使用错误或培养基品质不佳；血清使用错误或血清的品质不佳；或者消化过度，对细胞有严重影响；或者是传代比例不合适；细胞存在污染等。

五、细胞在培养中常出现黑点

首先肉眼观察培养液是否变浑浊，如果变浑浊，基本可以确定是污染;如果肉眼观察培养液没有变浑浊：在显微镜下观察黑点大小和形状是否规则，是否运动，是做布朗运动还是呈直线型快速移动。如果黑点大小不规则，做布朗运动，黑点可能是细胞碎片(可能是细胞状态不佳或者消化过度引起的)，也可能是血清反复冻融产生的蛋白沉淀引起的，也可能是细胞的代谢产物。如果黑点大小一致，快速移动，很可能是细菌污染。

六、细胞成团的原因

1. 消化时吹打太用力，消化太久，消化液太强或有毒性等细胞死亡释放出DNA，缠绕其他细胞，形成黏性的细胞团。

2. 细胞离心速度过大或时间太长。

3. 消化不wan全的时候，细胞和细胞之间的连接没有分开；消化过度的时候，圆形的细胞容易聚堆，再分开很困难！

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