​Tunel检测的实验步骤与注意事项

TUNEL检测是一种用于检测细胞凋亡（程序性细胞死亡）的方法。细胞凋亡是一种重要的细胞生物学过程，它在多种生理和病理情况下发挥作用，包括发育、组织修复和免疫应答等。那么你知道Tunel检测的实验步骤与注意事项吗？让我们一起来看看吧！

一、Tunel检测的操作步骤

1. 脱蜡和组织复性

将组织在二甲苯中浸泡两次，每次10-20分钟。在100%乙醇中洗涤两次，每次5分钟。然后依次在95%，70%和50%乙醇中洗涤3分钟。

2. PBS洗涤和蛋白酶处理

用200-500 µL PBS洗涤样品两次，每次5分钟。排除组织中多余的PBS，并在20 µg/mL蛋白酶K溶液中孵育15分钟。

3. TdT标记反应缓冲液/反应混合物孵育

配制TdT标记反应缓冲液。向每个样品中加入50 µL反应混合物，并在湿盒中避光下37℃孵育2小时。

4. PBS洗涤和DAPI复染

在PBS中将样品洗涤3次，每次5分钟。通过在1×DAPI中孵育10分钟对样品进行复染。

5. 观察和拍照

将样品在PBS中洗涤3次，每次5分钟。然后加入水性封固剂或防淬灭溶液，封住盖玻片。最后使用荧光显微镜观察，并进行荧光显微镜拍照观察，红色通道（Ex/Em=555 nm/565 nm）。

二、注意事项

1. 设立阳性和阴性细胞对照：

阳性组：用DNase酶处理，诱导细胞凋亡，使3'-OH末端暴露。每次实验只需做一个阳性组。

阴性组：不加TdT酶，其余操作和实验组相同。

实验组：除了阳性组和阴性组，所有样本均属于实验组。

2. 选择固定液：

建议使用4%多聚甲醛（PBS）进行固定。不建议使用乙醇和甲醇作为固定液。不要选用含有甲醇的甲醛替代品，因为这会降低标记效率，使荧光观察困难。

3. 贴壁细胞处理：

贴壁细胞在加药诱导凋亡后，细胞状态会发生改变，形态会皱缩边缘，贴壁粘附力降低。在对这些细胞进行实验染色时，需要小心操作，避免吹打造成细胞脱落。特别是在多次洗涤细胞时，操作要小心轻柔。

4. 避光操作和孵育：

荧光基团长期暴露在普通光照下，会发生严重淬灭。

在实验操作中应尽量避光操作和孵育，以保证荧光观察效果。

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