细胞克隆实验的操作方法

细胞克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等项目的重要技术方法。克隆形成依据采用的培养介质的不同，可分为平板克隆和软琼脂克隆两类。那么你知道这两种细胞克隆实验的操作方法吗？让我们一起来看看吧！

一、平板克隆

1. 所需材料

基础培养基（根据细胞选择适用种类）

胎牛血清、胰蛋白酶、PBS、青霉素-链霉素溶液（100X）、多聚甲醛固定、结晶紫染液、Giemsa染液、

2. 实验步骤

（1）6孔板

1）将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，wan全培养基（基础培养基+10%胎牛血清）重悬成细胞悬液，并计数；

2）细胞接种：于6孔板培养板中各实验组接种400-1,000个细胞/孔（根据细胞生长情况确定，一般为700个细胞/孔）;

3）继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3天进行换液并观察细胞状态；

4）克隆完成后，在显微镜下对细胞进行拍照，然后PBS洗涤1次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min，PBS洗涤1次；

5）每孔加入结晶紫染液1ml，染细胞10-20 min；

6）PBS 洗涤细胞数次，晾干，数码相机拍照（分别对整个六孔板及每个孔进行单独拍照）。

（2）平皿

1）取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在wan全培养基（基础培养基+10%胎牛血清）中备用。

2）将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组5个平行样。每组细胞每皿分别接种100个细胞于含10ml 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。

3）置37℃、5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。

4）当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。

5）加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml，固定15分钟。

6）去固定液，加适量Giemsa应用染色液染10～30分钟

7）用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

8）将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。

克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%

3. 数据分析

显微镜下观察阳性克隆，即每个克隆>50个细胞，相机拍照，数克隆数（大小约在0.3-1.0 mm）计算克隆形成率，并统计克隆大小。

二、软琼脂克隆形成

软琼脂克隆形成又名非锚定依赖性生长实验Anchorage-independent assay，利用软琼脂为培养介质，使细胞在悬浮状态下生长。
某些恶性肿瘤细胞，不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下也能增殖，进而通过软琼脂中形成克隆的能力反映了恶性程度，可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。

1. 实验步骤

1）配制1.2% 和0.7%琼脂，高压灭菌后，维持在42℃中使其不会凝固；

2）将1.2% 琼脂与2×培养基混合，铺入6孔板作为下层胶，每孔1.5ml，37°C孵育30 min使之凝固；

3）将制备好的单细胞悬液与0.7%琼脂充分混匀，加入6孔板作为上层胶，每孔1.5ml。待其凝固后，再在上面加入培养基，每3天更换一次；

4）根据细胞的生长速度培养2~3周后显微镜下观察克隆大小，与平板克隆一样，每个克隆>50个细胞，显微镜拍照。若拍整个孔，每孔加入200μl氯化硝基四氮唑蓝（NBT）染色，37°C过夜，拍照。

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