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022-66387942NEB-Q5定点突变试剂盒(不含感受态细胞)可以在 2 小时内快速对双链质粒DNA进行定点突变。该试剂盒使用稳定的Q5热启动超保真 DNA 聚合酶,结合客户自行设计的引物,在各种质粒中引入插入、缺失和替换突变。PCR 后将扩增材料直接添加到du特的激酶-连接酶-DpnI(KLD)酶混合液中,进行快速室温环化和模板去除(5 分钟)。操作方便、简单,只需一天时间便可完成整个操作,并且不受载体、宿主菌的限制。
操作使用:
步骤 I:指数扩增 (PCR)
1. 将以下试剂组装在薄壁PCR管中。
2. 将试剂wan全混合,然后转移到热循环仪中。
3. 执行以下循环条件: 常规PCR的热循环条件:
* 有关诱变引物的 Q5 优化退火温度,请使用在线 NEB 引物设计软件 NEBaseChanger™。对于预先设计的背靠背引物组,可以应用 Ta = Tm + 3 规则,但可能需要进行优化。
注意:我们建议通过在琼脂糖凝胶上观察 2–5 μl 反应来确保 PCR 产物干净。
第二步:激酶、连接酶和DpnI(KLD)处理
1. 组装以下试剂:
2. 上下移液充分混合,在室温下孵育 5 分钟。
第三步:转型
1.在冰上解冻50μl化学感受态大肠杆菌细胞[NEB 5-α感受态大肠杆菌(高效),NEB #C2987]。
2.将步骤II中的5μlKLD混合物加入解冻的细胞管中。小心地轻弹管子 4-5 次以混合。不要涡旋。
3. 将混合物放在冰上 30 分钟。
4.在42°C下热休克30秒。
5. 放在冰上 5 分钟。
6. 将 950 μl 室温 SOC 移液到混合物中。
7. 在 37°C 下振荡 (250 rpm) 孵育 60 分钟。
8. 通过轻弹试管和倒置彻di混合细胞,然后将 50-100 μl 铺展到选择板上,并在 37°C 下孵育过夜。 可能需要(特别是对于简单的替换和删除实验)在铺板之前将 SOC 中的转化混合物稀释 10 到 40 倍,以避免菌落的草坪
产品选购:
货号 | 产品名称 | 规格 |
E0552S | 定点突变试剂盒(不含感受态细胞) | 10 reactions |