Trizol法RNA提取的实验流程和注意事项

　　Trizol是一种酸性试剂，能从细胞和组织中快速分离RNA，其主要成分为异硫氰酸胍(GITC)和苯酚。裂解细胞后，GITC能使蛋白质和RNase变性，有利于保护RNA的完整性；加入氯仿离心后，样品分为水相和有机相，RNA存在于上层水相中，而DNA和蛋白质则存在于中间层及下层有机相中，从而达到分离的目的。简单来讲就是裂解细胞使RNA得以释放，加之有机溶剂使RNA与DNA、蛋白质分离，并进一步纯化得到RNA的过程。那么你知道Trizol法RNA提取的实验流程和注意事项是什么吗？让我们一起来看看吧！
 

　　1.样品的制备
 

　　1)细胞：按1ml Trizol试剂/5-10×10^6细胞的比例加入Trizol试剂(注：一般来讲待细胞在六孔板上生长至80%左右时，每孔收集的细胞加1ml Trizol即可)；
 

　　2)组织：按1ml Trizol试剂/50-100mg组织的比例加入Trizol试剂并在冰上匀浆处理，以利于RNA的释放(注：组织可以先用液氮急冻后研磨处理，也可用匀浆器或者组织研磨器进行处理，但要注意保持低温，以防RNA降解)；
 

　　室温裂解5-10min。
 

　　2.氯仿抽提
 

　　每1ml Trizol中加入200ul的氯仿，盖好EP管盖后用手剧烈颠倒混匀15s左右，室温孵育2-3min。2-8℃，12000g离心15min后溶液分为三层，从上到下依次为水相(RNA)、中间层及有机相(DNA、蛋白质等)，转移水相至新的EP管中(注：此步一定要小心谨慎，慢慢吸取，不可触及中间层，以免RNA被污染)。
 

　　3.异丙醇沉淀
 

　　每1ml Trizol中加入500ul异丙醇，上下颠倒混匀后，室温孵育10min，2-8℃，12000g离心10min，得到的白色沉淀即为RNA沉淀(注：异丙醇最好提前预冷，维持低温环境，以防RNA被降解)。
 

　　4.乙醇洗涤
 

　　弃去上清，加入1ml 75%乙醇(每1ml Trizol)洗涤RNA沉淀，2-8℃，7500g离心5min(注：75%乙醇可以用无水乙醇及无酶水来配制，同样最好预冷处理；清洗时动作要轻柔，过于剧烈会导致RNA沉淀散开，再次离心未免会重聚，从而造成RNA的损失)。
 

　　5.溶解
 

　　弃去上清，于通风橱内干燥RNA沉淀5-10min，用50ul左右的无酶水重悬沉淀，即可得到RNA溶液(注：干燥时间不可过长，太过干燥会导致沉淀很难溶解，部分溶解的RNA的260/280的比值会大大降低，甚至低于1.6；亦可采用金属浴60℃，5min以助溶)。
 

　　6.RNA质量的检测
 

　　1)微量分光光度计
 

　　纯RNA的260/280比值在2.0左右，若比值偏小，则代表可能有蛋白或有机溶剂的污染，比值偏大则代表RNA可能发生降解。
 

　　2)琼脂糖凝胶电泳
 

　　可见三条带，从上往下一般为28s RNA、18s RNA及5s RNA，一般情况下5s的带非常淡，甚至看不清，28s带的亮度应为18s带亮度的2倍，且不存在拖尾，即可证明RNA纯度可以，如若5s很明显，而28s 与18s带的亮度并无太大差别，甚至出现涂抹状的条带则高度提示RNA降解。
 

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