qPCR实验的注意事项有哪些？

　　q是指在PCR体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过C-值和标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。那么你知道qPCR实验的注意事项有哪些吗？让我们一起来看看吧！
 

　　一、模板制备
 

　　在进行qPCR实验时，需要根据所用试剂盒说明书加入适量的起始核酸模板，过多的模板可能提高污染物含量，大大降低 PCR 效率，过少的模板可能会降低检测灵敏性和重复性。
 

　　根据检测靶标的性质特点，选择合适的核酸抽提试剂盒同样至关重要。小编有遇到老师想要通过qPCR的方法完成对microRNA的定量，但是发现待检测样本中目标microRNA和内参基因的扩增曲线出峰时间都比较晚，内参基因的Ct值甚至大于30(图2)。排除实验操作问题后发现原来是因为所使用RNA抽提试剂盒对小片段的microRNA回收效率低，不适合用于下游microRNA定量实验。
 

　　二、引物探针的设计及储存
 

　　除了要保证模板的质量外，引物探针的设计和稳定性同样至关重要。当我们根据检测靶标设计特异性引物和探针时，除了要考虑片段长度，Tm值，碱基组成等基本要点外，还需格外注意引物，探针自身不能形成复杂的二级结构，上下游引物内部，引物探针之间不能出现结合的现象，因为这些都可能影响引物探针与目标基因的结合，进而影响最终的扩增效率。
 

　　除了引物探针在设计时需要格外花费心思外，收到合成好的引物、探针如何稀释，如何保存同样有小tips。如果我们合成的引物探针是干粉状或是需要稀释时，为了保证引物探针的稳定性建议用1×TE buffer去溶解和稀释。另外，引物的储存浓度也可能影响其稳定性，建议引物的储存浓度不低于 10 μM，一般为100 μM 。此外如果引物和探针每次使用量较少时，还应该进行分装，保存在-20℃，以减少反复冻融的次数。
 

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