天根感受态细胞(CB104-01)现货供应

感受态细胞转化效率高达 108 cfu/µg，具链霉素抗性，其转化后单菌落的生长数多，生长速度比 DH5α 略快，相同培养时间内生长的菌斑略大于DH5α。适用于高效的 DNA 克隆和质粒扩增。能保证高拷贝质粒的稳定复制。

操作步骤：

使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。

1. 柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12,000 rpm（~13,400×g）离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（使用当天处理过的柱子）

2. 取1-5 ml过夜培养的菌液加入离心管中，12,000rpm （~13,400×g）离心1 min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

3. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250μI溶液P1（请先检查是否已加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻di悬浮细菌细胞沉淀。

注意：如果有未彻di混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

4. 向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻di，应减少菌体量。

5. 向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12,000rpm（~13,400×g）离心10min，用移液器小心地将上清转移到过滤柱CS（过滤柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。

注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

6. 12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，小心地将离心后收集管中得到的溶液转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），（如果过滤柱中有残余的液体说明步骤5吸取的上清中杂质过多，可以延长离心的时间；如果离心后收集管底部有少量的沉淀，尽量的吸取上清）。

7. 12.000 rpm （~13,400×g）离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

8.向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm （~13.400×g）离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

 9. 向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

10.重复操作步骤9。

11.将吸附柱CP3放入收集管中，12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻di晾干吸附材料中残余的漂洗液。

12.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-100μI洗脱缓冲液TB，室温放2min,12,000rpm（~13,400×g）离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。

注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，重复步骤12。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用ddH20做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收效率。且DNA产物应保存在-20°C，以防DNA降解。

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