abclonal爱博泰克BRCA1兔多抗(A11034)现货供应

产品名称：abclonal爱博泰克BRCA1兔多抗(A11034)现货供应

产品货号：A11034

产品品牌：abclonal爱博泰克

实验流程：

蛋白免疫印迹实验步骤：

1、样品制备

（1）细胞收集

a. 贴壁培养细胞收集

用细胞刮刮下细胞或用胰酶消化处理后，400×g，离心5 min，弃上清；用适量冰PBS溶液将离心后细胞沉淀重悬，4℃，400×g 离心5min,弃上清，重复清洗步骤一次收集细胞沉淀。

b. 悬浮培养细胞收集

收集悬浮细胞，400×g离心5min，弃上清，适量冰PBS溶液将离心后细胞沉淀重悬，4℃，400×g 离心5min,弃上清，重复清洗步骤一次，收集细胞沉淀。

c. 组织样本收集

把组织在预冷的表面上剪切成细小碎块，然后用液氮或超低温冰箱中冷冻组织30min以上，迅速加液氮研磨，研磨过程尽量控制在1~2min之内，以减少蛋白的降解。

（2）总蛋白提取

a. 细胞/组织裂解：

根据收集的细胞数量、细胞种类添加适量的裂解液。

例如常规细胞沉淀可按照1mL裂解液/107个细胞的比例加入相应体积的裂解液，加入裂解液后将沉淀吹打混匀。使用细胞破碎仪超声样本，每次超声时间4-5s,间隔时间在5s左右，肉眼观察，样本为均一，不粘稠液体即可。或采用震荡裂解方式进行，每隔5min将离心管置于涡旋振荡仪上震荡10s，裂解20min。

组织碎片可按照0.5mL 裂解液/100mg组织向匀浆器中加入蛋白裂解液，每3min研磨一次，重复5次，使组织尽量碾碎（裂解液中根据需要添加或不添加蛋白酶抑制剂）。所有理解过程，务必在低温条件下进行。

b. 离心：

把裂解好的样品配平后，将裂解好的样本置于预冷的高速冷冻离心机中，13000×g离心10min，收集上清

c. 蛋白变性：

吸取少量蛋白提取液做蛋白浓度测定。向剩余的蛋白提取液的离心管中加入对应体积的5× Loading Buffer（最终工作液为1×)，待干式恒温器温度升至95℃后，将1.5mL离心管插入加热孔中，95℃加热变性10min，待液体冷却后置于-20℃保存。

（3）蛋白浓度测定（BCA法）

a. BCA工作液的配置

根据样品数量，按50体积BCA试剂A加入1体积BCA试剂B（50:1）配置适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24h内稳定。

b. BSA标准品梯度稀释

取10μl蛋白标准品（5 mg/mL BSA）稀释至50μl，使终浓度为1mg/ml。稀释后的蛋白标准品可以-20℃长期保存。此标准品溶液的稀释液可使用去离子水或1×PBS。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入到96孔板中，加稀释液补足到20μl。

c. 样本浓度测定

加适当体积样品到96孔板的样品孔中，如果样本不足20μl，需加稀释液补足到20μl。每孔加入 200μl BCA工作液，37℃放置20-30min。用酶标仪测定样本和标准品在562nm下的吸光度，或在540-595nm之间波长下的吸光度。根据BSA蛋白浓度标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。

2、凝胶电泳

（1）制胶器安装

根据使用说明书安装。

（2）凝胶配置

根据目标蛋白大小，选择不同合适浓度的分离胶（见附表）。注意该过程注意不能有气泡产生。

（3）上样

待胶凝固好后，用移液器吸取样品垂直梳孔上样，建议总蛋白上样量25ug/孔。注意内槽Tris-Glycine SDS Running Buffer需注满，外槽Tris-Glycine SDS Running Buffer没过底部3~5cm即可。

（4）电泳

上样完成后，连通电泳仪电源，注意正负极需连接正确，设定适宜的电泳参数。建议浓缩胶电泳参数为恒压80V，分离胶采用恒压120V。当溴酚蓝电泳到凝胶底部时，停止电泳，关闭电泳仪电源。

3、转膜

（1）准备工作

a. 转膜缓冲液可提前2h （即开始电泳后）放入-20℃冰箱预冷。

b. 根据胶的面积大小，将滤纸以及NC膜剪裁至合适尺寸。

c. 建议目的蛋白大于20KD可选择0.45μm NC膜；目的蛋白小于20KD可选择0.2μm的NC膜或0.22μm的PVDF膜。选择完毕后将膜放在Western Transfer Buffer中浸泡备用。注意使用PVDF膜需先放入甲醇中浸泡1min左右至均匀浸透，没有白点即可放入Western Transfer Buffer中浸泡备用。

（2）转膜

根据目的蛋白大小，选择合适的转膜条件（见附表）。

4、封闭

转膜完成后，将膜取出，放入合适的抗体孵育槽中，加入Western Blocking Buffer 室温孵育1h，加入TBST Buffer洗涤3次，每次5 min。

5、抗体孵育

根据所使用的一抗种类，选择进行下述其中1项的具体步骤

（1）对于无偶联的一抗

a. 将一抗用Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按照抗体说明书推荐比例进行稀释,室温孵育1.5h或4℃过夜孵育。

b. TBST Buffer洗涤4次，每次5 min。

c. 按一抗来源选取合适的HRP偶联二抗，按照合适比例进行稀释，室温孵育1h。

d. TBST Buffer洗涤4次，每次5 min。

e. 继续进行后续曝光操作。

（2）对于偶联有HRP的一抗

a. 将一抗用Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按照抗体说明书推荐比例进行稀释,室温孵育1.5h或4℃过夜孵育。

b. 用TBST Buffer洗涤4次，每次5 min。

c. 继续进行后续曝光操作。

6、曝光

a. 吸取等体积ECL SolutionⅠ和SolutionⅡ混匀，配制成发光检测工作液。推荐用量为每10cm2的膜使用1-2 mL发光检测工作液即可。

b. 用镊子将膜取出，膜的下缘轻轻接触吸水纸，去除膜上多余的液体。用移液枪吸取工作液并均匀覆盖转印膜，室温孵育 1-2 minutes，此步骤可在洁净保鲜膜上或塑料盒中完成。

c. 获取WB结果：

1) 传统压片曝光显影：将膜固定于片夹内。暗室内压片1分钟，立即显影定影，根据结果再调整压片时间获取最佳信噪比图片。或直接分别压片 30 秒、1、3、5分钟，然后一起显影定影观察结果。

2) 化学发光成像仪获取电子图片：将膜放置到成像仪内，参考仪器说明书设置合适的参数以获取优化图片。同时应根据靶蛋白的生物学性质如丰度等来调节成像参数。

相关文献：

[1] Gene dosage effects of poly(A) track-engineered hypomorphs;

[2] The P286R mutation of DNA polymerase ε activates cancer-cell-intrinsic immunity and suppresses endometrial tumorigenesis via the cGAS-STING pathway - PMC.

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