碧云天beyotime酵母质粒小量抽提试剂盒(D0029)现货供应

产品名称：碧云天beyotime酵母质粒小量抽提试剂盒(D0029)现货供应

产品货号：D0029

产品品牌：碧云天beyotime

使用方法：

1.取培养过夜的酵母1.5毫升，5000g离心1分钟收集酵母沉淀，弃上清。再重复一次，每管共收集3毫升培养过夜的酵母。再在离心机快速离心一下(5000g离心1-2秒)，用移液器小心吸尽残余液体。

通常酵母宜30°C培养过夜(16-24小时左右)。建议5000g(～5000-6000rpm)室温离心1分钟，如沉淀不充分则适当延长离心时间。时间过长或离心速度过快会使沉淀过于紧密，不利于后续加入溶液I后充分重悬沉淀。直接倒掉上清，再倒入约1.5毫升酵母液并重复上述的离心操作，然后直接倒掉上清，再在离心机快速离心一下(5000g 1-2秒)，用移液器小心吸尽残余液体。残余液体必须吸尽，否则可能会干扰后续的酶解反应。如果酵母密度明显偏低，可考虑使用更多酵母液，再重复上述操作1-2次。所用酵母量一般不宜超过5ml。过量的酵母会导致后续的酶解和碱裂解不充分。

2.每管加入100微升酶解缓冲液，重悬酵母沉淀。确保沉淀散开，无可见酵母团块。

可以通过剧烈Vortex来重悬沉淀。

3.加入20微升配制好的Lyticase溶液，充分混匀，30℃水平摇床200-250rpm孵育0.5-1小时。

注意：根据酵母菌株和酵母细胞数量的不同，酶解的孵育时间可进行适当调整。当酵母用量较大时，酶解的孵育时间需延长。孵育时间延长到2-3小时通常不会对质粒抽提带来负面影响。

4.1500g (～3000-4000rpm)离心10分钟，弃上清，收集沉淀。

直接倒掉上清，然后倒置于吸水纸上(可用普通草纸)，使液体流尽。也可在直接倒掉上清后再在离心机内甩一下，用移液器吸尽残留液体。不同离心机因离心半价的不同g和rpm的换算值有所不同。

5.每管加入250微升溶液I，重悬酵母沉淀。确保沉淀散开，无可见酵母团块。

确认溶液I中已经添加了RNase A。由于此时酵母细胞壁已经去除，重悬操作要温和，不宜剧烈振荡，否则会容易导致基因组DNA的污染。但同时必须保证沉淀充分散开，即必须确保酵母细胞充分分散到溶液中。

6.每管加入250微升溶液II，轻轻颠倒离心管4-6次，使菌体裂解，溶液透明。

切勿vortex！vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致最终所得质粒被基因组DNA污染。遇到有少量团块或絮状物产生的情况，可以增加颠倒次数3-5次，再室温放置2-3分钟，但总裂解时间不可超过5分钟。

7.每管加入350微升溶液III，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。

切勿vortex！颠倒次数也不宜过多，否则易导致最终所得质粒的质量下降。

8.最高速(13,000rpm左右)室温离心10分钟。

离心后会产生白色沉淀。离心时准备好下一步需使用的质粒纯化柱，废液收集管，并在纯化柱上做好标记。

9.将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。最高速离心30-60秒，倒弃收集管内液体。

质粒倒入质粒纯化柱后，可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。

10.在质粒纯化柱内加入750微升溶液IV，最高速离心30-60秒，洗去杂质，倒弃收集管内液体。

加入溶液IV后可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。

11.最高速再离心1分钟，除去残留液体并使痕量乙醇挥发。

注意：倒弃收集管内液体后再离心，才能去除微量的溶液IV。微量的溶液IV会影响质粒的质量。

12.将质粒纯化柱置于1.5毫升离心管上，加入50微升溶液V至管内柱面上，放置1分钟。

溶液V需要直接加至管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。如果不慎将溶液 V沾在管壁上，一定要震动管子，使液体滑落到管底，以便被纯化柱吸收。也可以用重蒸水或 Milli-Q级纯水替代溶液V，但是水的pH应不小于6.5。溶液V加入后放置时间稍长，对于增加质粒产量会略有帮助。

13. 最高速离心1分钟，所得液体即为高纯度酵母质粒。

相关文献：

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[4]Hui Wang, Wenrui Zhang, Rujiao Liu, Jiaoyun Zheng, Xueping Yao, Hui Chen, Jie Wang, Horst Christian Weber, Xiaoqun Qin, Yang Xiang, Chi Liu, Huijun Liu, Lang Pan, Xiangping Qu . Lack of bombesin receptor-activated protein attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice Life Sci Alliance. 2022 Jul 12;5(11):e202201368. doi: 10.26508/lsa.202201368.

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