影响质粒构建实验的因素

　　质粒最早是20世纪50年代初期在大肠杆菌中发现的，是细菌、酵母菌、放线菌等生物中独立于染色体(或拟核)以外的闭合环状双链DNA分子，具有自主复制能力，可在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。那么你知道影响质粒构建实验的因素有什么吗？让我们一起来看看吧！
 

　　一、载体的选择
 

　　在选取克隆载体时应留意以下几点：
 

　　①具备自主复制能力，拷贝数量众多；
 

　　②携带易于筛选的选择标记；
 

　　③含有多种限制酶识别序列，以供外源基因插入；
 

　　二、引物设计留意事项
 

　　在构建质粒时，设计引物时应考虑引物长度、引物的GC含量、引物的Tm值等因素，并避免引物间出现配对突变或次级结构等情况。
 

　　前向引物：5’端–上游克隆载体末端同源序列 + 基因正向扩增引物 --3’端
 

　　反向引物：3’端–基因反向扩增引物 + 下游克隆载体末端同源序列 --5’端
 

　　在运用PCR扩增目的基因的过程中，引物设计需留意事项：
 

　　① 引物长度最好在18-30bp左右，常用的长度是 20-22bp；
 

　　②引物 Tm 值最好在 60℃ 左右，两条引物间 Tm 值要保持接近，相差最好不要超过 5°C；
 

　　③GC 的含量标准通常为 40%-60% 或45-55%；
 

　　三、酶切位点的选择
 

　　在构建质粒时，选择适当的切割酶和连接酶至关重要。对于切割酶的选择，应该考虑到酶切位点的位置以及酶的反应条件等因素。而对于连接酶的选择，则应根据所使用的质粒载体和目标基因的大小来确定。
 

　　①选择质粒上两个酶切位点之间的距离不宜过小(>10bp)，否则会影响限制性内切酶对切点的识别，从而不利于空载体的双重酶切。
 

　　②在克隆表达目的基因的情况下，选择酶切位点时应考虑以下因素：
 

　　目标基因片段内不应含有所选酶切位点(否则在检验阳性重组子的双重酶切时可能会切断目标基因)。
 

　　③在后续实验中使用的所有载体(真核、原核、酵母、昆虫)尽可能含有所选的酶切位点，并且要确保插入载体时的方向正确(即定向克隆)，以免在更换载体进行表达时需要重新设计引物以引入新的酶切位点。
 

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