PCR和凝胶电泳实验结果常见的问题及原因分析

　　为了排除某些因素对PCR结果的影响，PCR实验需要对照实验。PCR的阳性对照是Marker，推测PCR产物长度，判断PCR产物是否是目的片段。PCR的阴性对照是PCR的空白管，除了模板不加之外，其成分与其他管一样，证明没有其他模板污染。下面让我们一起来看看PCR和凝胶电泳实验结果常见的问题及原因分析吧！
 

　　一、耗材选择不当对实验结果造成很大的影响
 

　　PCR耗材一般都是聚丙烯(PP)材质，因其为生物学惰性材料，表面不易于粘附生物分子，且有着良好的化学耐性，及温度耐受性。这些材料通常会与试剂或者样品直接接触，因而在生产制备过程中需要选用高质量的材料和良好的加工工艺。
 

　　PCR管的体积大多数都可以满足PCR反应要求。但是在满足实验要求的基础上，优先推荐选用低容管。因为低容反应管有着较小的上方空间，可提高热传导率并降低蒸发。而且在加样时，需要避免加样过量或过少。过量会导致热传导率下降，溢出及交叉污染，而加样过少可能会造成样品蒸发损失。
 

　　二、假阴性(无扩增产物)——现象：阳性对照有条带，而样品则无
 

　　原因：模板含有抑制物，含量低；缓冲液(Buffer)对样品不合适；引物设计不当或者发生降解；反应条件：退火温度太高，延伸时间太短。
 

　　对策：纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量；更换Buffer或调整浓度；重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或者换一管新引物；降低退火温度、延长延伸时间。
 

　　三、非特异性扩增——条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带
 

　　原因：引物的特异性不强、提取模板DNA中可能会有非靶基因性同源序列；模板或引物浓度过高；酶量过多；Mg2+浓度偏高；退火温度偏低；循环次数过多。
 

　　对策：重新设计引物；适当降低模板或引物浓度；适当减少酶量；降低镁离子浓度；适当提高退火温度则减少与同源性非靶DNA的互补程度；减少循环次数。四、拖尾——产物在凝胶上呈模糊不清状态(弥散)
 

　　原因：模板不纯；引物浓度不够优化；Buffer不合适；退火温度偏低；酶量过多；dNTP、Mg2+浓度偏高；循环次数过多。
 

　　对策：纯化模板；对引物进行梯度稀释；更换Buffer；适当提高退火温度；适量用酶；适当降低dNTP和镁离子的浓度；减少循环次数。
 

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