细胞复苏实验的操作步骤与注意事项

　　细胞复苏是指将冻存在液氮或者-70℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养，细胞恢复生长的过程。当恢复到常温状态时，细胞的形态结构保持正常，生化反即刻恢复。细胞复苏过程升温要快，原则是慢冻快融，防止在解冻过程中水分进入细胞，形成冰晶，影响细胞存活。下面让我们一起来看看细胞复苏实验的操作步骤与注意事项吧！
 

　　一、操作步骤
 

　　1.将10ml移液管、移液枪、1ml枪头、50ml离心管、T25培养瓶、酒精灯、废液缸等物品放入超净工作台，紫外灯照射30min后再通风30min；
 

　　2.预热培养基；
 

　　3.用75%酒精消毒后放入超净工作台；
 

　　4.将冻存细胞从液氮罐中取出；
 

　　5.放入一次性手套于37℃水浴锅中快速晃动使其融化；
 

　　6.用75%酒精消毒后放入超净工作台；
 

　　7.吸取9ml培养基到50ml离心管中；
 

　　8.用1ml枪头吸取解冻的细胞悬液于离心管中；
 

　　9.1000r/min,离心5min；
 

　　10.用75%酒精消毒后放入超净工作台；
 

　　11.吸弃上清液；
 

　　12.吸取1ml培养基重悬细胞，将细胞悬液转移到培养瓶内，补加适量培养基，轻轻晃动培养瓶使细胞分布均匀，并做好标记；
 

　　13.在显微镜下观察复苏的细胞密度及状态；
 

　　14.将细胞放回二氧化碳培养箱中静置培养。
 

　　二、注意事项
 

　　1.从液氮罐中取出细胞时，应做好个人防护以免冻伤；
 

　　2.冻存细胞取出后，如不能立即放入水浴锅中融化，需将其放在干冰上保存转移；
 

　　3.细胞水浴解冻时间以1min内为宜，做到慢冻速融；
 

　　4.已解冻的细胞避免长时间常温存放，需尽快离心去除DMSO；
 

　　5.刚复苏的细胞贴壁尚不牢固，24h内不要频繁观察和换液；
 

　　6.将培养瓶放入培养箱，并将瓶盖旋松，以便进行充分的气体交换(如使用透气性瓶盖，则无需旋松瓶盖)。
 

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