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如何区分染色体DNA和质粒 DNA

 更新时间:2024-09-20    点击量:614

一、前言

在质粒提取中,其原理是基于生物大分子在物理和化学性质上的差异,通过变性、复性、沉淀和纯化等实验步骤进行区分提取。蛋白质在碱性环境下容易发生变性,使用 SDS (十二烷基硫酸钠)等去垢剂破坏细胞膜时,SDS 与蛋白质发生变性,形成复合物,使其沉淀;RNA 通常会加入 RNase 降解 RNA,但一般 RNase 的加入时间通常在细菌/细胞裂解之后、质粒 DNA 纯化之前,以确保 RNA 被充分降解;最关键的问题是: 如何将染色体 DNA 和质粒 DNA 区分出来?

二、如何区分染色体DNA和质粒DNA

细菌没有细胞核,只有一个拟核(nucleoid),而染色体 DNA 是环状的,但并非裸露的,上面结合有多种 NAPs(nucleoid-associated proteins)NAPs 和基因转录活性可以改变拟核的形态结构。这样的话,质粒 DNA 就要简单很多,游离于细胞质中,以共价闭环 cccDNA(convalently closed circular DNA)的形态存在。

在强碱和 SDS 的条件下,染色体 DNA会被降解成线性片段并发生变性。当加入中和液(如醋酸钠)后,染色体 DNA 虽然会复性,但无法恢复其原始的双链结构,而是形成一团缠绕在一起无法溶解的网状结构,通过高速离心,这些变性的染色体 DNA 会与 SDS-protein 复合物一起沉淀到管底,从而与质粒 DNA 分离;然后在强碱环境下,质粒 DNA虽然也发生一定程度的变性,但其两条互补链仍会紧密盘绕在一起,保持双链结构,加入中和液后,质粒 DNA 能够迅速复性,恢复其天然的双链结构,并以溶液状态存在于上清液中,通过后续纯化步骤(过柱或磁珠吸附),可以进一步获得高纯度的质粒 DNA

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