镍柱纯化实验原理及操作步骤

一、实验原理

‌镍柱纯化实验的原理基于固定化金属离子亲和色谱(IMAC)‌，这是一种利用金属离子与配体之间的特异性相互作用来分离蛋白质的方法。镍柱纯化利用Ni2+与带有咪唑基团的组氨酸(His)标签的蛋白质之间的相互作用，从而实现目的蛋白的纯化。具体来说，镍柱中含有Ni2+离子，这些离子能够与组氨酸上的咪唑基团形成配位键，从而选择性结合带有His标签的目的蛋白。由于不带His标签的蛋白无法与Ni2+形成配位键，因此能够有效地区分目的蛋白与非目的蛋白。

在纯化过程中，首先通过Binding buffer平衡镍柱，接着将蛋白质样品上样到镍柱上。此时，带有His标签的目的蛋白会与镍柱上的Ni2+结合，而非目的蛋白则流穿镍柱。随后，通过增加咪唑浓度的Washing buffer洗去非特异性结合的杂蛋白。最后，使用高浓度的咪唑缓冲液（Elution buffer）与His标签竞争结合Ni2+，从而将目的蛋白洗脱下来，完成纯化过程。

二、操作步骤

① 准备工作：

（1）根据目的蛋白的性质，选择合适的镍柱类型和洗脱方式，配制合适PH值的缓冲液和洗脱液。

（2）缓冲液和洗脱液在蛋白纯化操作前用0.45 μm或0.22 μm滤头过滤除菌避免污染镍柱，减少寿命。

② 样品预处理：

预处理待纯化的蛋白样品，如离心去除杂质、调整样品的pH值、低浓度咪唑溶液透析以去除培养基中的EDTA和盐溶液等（具体操作需根据蛋白性质设计）。

③ 镍柱平衡及上样：

利用无咪唑或低浓度咪唑的缓冲液对镍柱进行平衡，待曲线维稳10 min左右，即平衡结束。平衡完成后，将处理完毕的样品缓慢且匀速地加入镍柱中，使目的蛋白与镍柱充分结合。

④ 除杂：

使用低浓度咪唑缓冲液（如2、5 、10、20、25 mM咪唑）冲洗镍柱，去除与镍柱非特异性结合的杂蛋白。该过程应合理控制流速和时间，以确保杂蛋白被wan全去除。

⑤ 洗脱：

为收集高纯度的目的蛋白，使用含有高浓度咪唑的洗脱液将目的蛋白从镍柱上洗脱下来。通过梯度洗脱的方式，逐步增加洗脱液中咪唑的浓度（如50、100、200、300、400、500 mM咪唑）。在目的蛋白shou次纯化实验中，应设置多个从低至高咪唑浓度的缓冲液，探索合适的洗脱条件。

⑥ 收集与分析：

收集含目的蛋白的洗脱液样品，利用SDS-PAGE电泳等方法对其进行分析以评估其纯度和浓度。

⑦ 清洗与保存：

使用ddH₂O冲洗镍柱，并用20%乙醇溶液冲洗并保存镍柱以防止微生物生长。

三、注意事项

① 在实验前查询并了解目的蛋白的性质（分子量、等电点、氨基酸组成、聚体等），并严格控制实验条件，如缓冲液的pH值和咪唑浓度，以确保实验的准确性和可重复性。

② 严格按照说明书操作，并且样品在上柱前需要进行预处理（高速离心、调PH或透析等），以保护镍柱，避免污染和损伤。

③ 在镍柱的使用中，应避免缓冲液中存在还原剂和螯合剂，以免 Ni²⁺ 被还原而脱落。

④ 镍柱纯化的效率受到多种因素的影响，包括蛋白质表面可结合的氨基酸的种类、数目和分布，金属离子的种类和密度，以及层析条件（如pH值、盐的种类和浓度、添加剂等）。通过优化这些条件，可以提高纯化的效率和目的蛋白的纯度。此外，镍柱在使用一段时间后可能需要再生，以去除积累的杂蛋白并重新活化镍柱，以保证其长期有效的使用‌。

⑤ 尽量收集镍柱纯化过程中每一步产生的洗脱液，以便实验结束后利用SDS-PAGE等方法对蛋白纯化过程进行进一步分析。

四、缓冲液推荐

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