WB实验中单层贴壁总蛋白的提取方法

一、前言

蛋白质印迹法（Western Blot）通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的分子生物学技术。Western Blotting实验单层贴壁细胞总蛋白的提取步骤：

二、操作步骤

1. 1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。

2. 2. 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH=7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

3. 3. 按1ml裂解液加10μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）

4. 4. 每瓶细胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

5. 5. 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）

6. 6. 于4℃下12000 rpm离心5min。（提前开离心机预冷）

7. 7. 将离心后的上清分装到0.5min的离心管中放于-20℃保存。

8. 以上步骤可简单概述为：收集细胞、裂解细胞、离心取上清、保存。

三、PBS推荐

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