RNA酶保护试验方法优缺点

一、工作原理

RNA酶保护法（RNase Protection Assay，RPA，以下简称RPA），是近十年发展起来的一种全新的mRNA定量分析方法。

基本原理：将标记的特异RNA探针（32P或生物素）与待测的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针按碱基互补的原则与目的基因特异性结合，形成双链RNA；未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待测目的基因与特异RNA探针结合后形成双链RNA，免受RNA酶的消化，故该方法命名为RNA酶保护实验。

二、RPA法优点

与Northern blot和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点：

1. 检测灵敏度比Northern杂交高。

由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。

2. 由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台"问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。

3.由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。

4.步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。

5.RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。

6.一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。

7. 检测分子长度可以任意设置，灵活性大。

三、RPA法缺点

‌RNA酶保护试验方法的主要缺点包括RNA探针的制备过程复杂、核酸酶消化时酶量的控制困难、需要使用放射性同位素。‌

‌RNA探针的制备过程复杂‌：该方法的前提是必须首先将研究的基因克隆到一个载体中，并清楚插入片段的方向。载体插入片段两侧需要有T3、T7或SP6的启动子位点。载体需要使用合适的内切酶线性化，并选择正确的体外转录试剂盒，转录出要研究的mRNA的互补链，再进行纯化。这一过程相对繁琐且技术要求较高‌。

‌核酸酶消化时酶量的控制困难‌：在核酸酶消化过程中，酶量的控制是一个挑战，因为酶量难以精确控制，容易导致消化过头，使得X片上没有任何显示。这表明实验操作对酶量的控制要求非常高，否则会影响实验结果的准确性‌。

‌需要使用放射性同位素‌：该方法需要使用放射性同位素进行标记，虽然这种方法防护相对容易，但由于使用了放射性物质，需要进行特殊的处理和防护措施。此外，该方法还需要进行垂直板状PAGE，并且涉及到大量的放射性物质，如电泳缓冲液、电泳槽、玻璃板、漂洗固定液及托盘等，这些都增加了实验的复杂性和安全性考虑。如果非同位素的标记和检测能够达到相同的灵敏度和成本效益，这将是一个改进的方向‌。

综上所述，虽然RNA酶保护试验方法在定量分析RNA方面具有高灵敏度和高特异性等优点，但其操作复杂、对实验条件要求高以及使用放射性同位素的限制是其主要的缺点。

四、品牌推荐

TwistDx试剂盒代理——天津益元利康生物科技有限公司，提供twistdx产品，如恒温扩增试剂盒、恒温扩增设备等，更多TwistDx品牌产品等，欢迎咨询！TwistDx Inc.由分子生物学家和蛋白质生物化学家Niall Armes博士与Derek Stemple博士和Nagesh Mahanthappa博士于1999年创立，总部位于美国马萨诸塞州剑桥市。

TwistDx 将扩大基于 RPA 的分子检测和技术在所有适用领域的应用，使科学家和技术开发人员摆脱高温 DNA 扩增技术的限制。

TwistDx详细产品列表：