ROS的检测方法

ROS在细胞生命，应激和死亡中具介导作用，今天让我们来聊下ROS吧~

一、ROS简介

活性氧（reactive oxygen species，ROS）广泛指代氧来源的自由基和非自由基，包含了超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（OH-）、臭氧（O3）和单线态氧（1O2），由于它们含有不成对的电子，因而具有很高的化学反应活性。

在机体内，ROS的主要来源之一是线粒体内膜的呼吸链底物端，在线粒体中的电子传递链复合物将电子传递给O2的过程中，有一部分O2被还原，形成O2-或H2O2。其中，最为重要的是O2-，它是大部分的ROS的前体，主要由线粒体内膜呼吸链中的蛋白酶复合体Ⅰ、Ⅲ产生。这部分作为代谢副产物的ROS长期被当作损伤生物大分子的毒性分子，但近年来被认为在较低水平时作为一类信号小分子具有生理作用，另一个ROS的重要来源是NADPH化酶，其催化亚基被称为NADPH氧化酶2（NADPHoxidase2，NOX2/gp91phax），能够在细胞质膜上表达。在不同的组织中已经鉴定了6种NOX-2的同沥物：NOX1，NOX3，NOX4，NOX5，DUOX1和DUOX2，统称为NOX家族蛋白。这些酶能通过质传递电子产生ROS，可以大量存在于吞噬细胞，也在其他各种组织细胞中以较低水平普遍存在，参与很多膜受体下游信号激活。

ROS保护细胞免受病原体的侵害，但较高浓度的ROS会诱发许多疾病，例如恶性肿瘤，糖尿病，关节炎，动脉粥样硬化，心脏病并增强衰老过程。

二、检测方法

目前有多种方法用于检测ROS，包括荧光染色法、电子顺磁共振技术（EPR）、化学发光法、色谱法、分光光度法、电化学生物传感器以及基于荧光蛋白等七种。在这里，我们将着重介绍荧光染色法，以及其在检测细胞内ROS时的原理和操作步骤。

检测原理

目前，用于检测细胞内ROSzuiguang泛采用的方法是DCFH-DA荧光探针法。DCFH-DA（二氯荧光黄双乙酸盐）是一种可指示的探针，其本身不具有荧光，但可以自由穿过细胞膜。一旦进入细胞，它会被细胞内的酯酶水解成DCFH。由于DCFH无法穿过细胞膜，因此荧光探针会在细胞内积聚。细胞内的ROS能够氧化无荧光的DCFH，生成有荧光的DCF，且荧光强度与ROS水平成正比。通过荧光显微镜、流式细胞仪或激光共聚焦显微镜等设备，在最大激发波长480nm和最大发射波长525nm下检测荧光信号。

检测步骤：

1.装载探针

1）先用无血清培养基稀释阳性对照（Rosup,100mM）到常用工作浓度100μM，对于刺激时间较短的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照（Rosup）或自己感兴趣的药物刺激细胞。

2）对于刺激时间较长的细胞，先用活性氧阳性对照（Rosup）或自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。

1.1原位装载探针（本方法仅适用于贴壁细胞）

1）细胞准备：检测前一天进行细胞铺板，确保检测时细胞密度达到50~70%。

2）诱导：去除细胞培养液，加入适量经合适的缓冲液或无血清培养基稀释到工作浓度的药物，于37℃细胞培养箱内避光孵育，具体诱导时间根据诱导物本身特性，以及细胞类型来决定。

3）探针装载：按照1:1000用无血清培养基稀释DCFH-DA，使终浓度为10μM。吸去诱导用药物，加入适当体积稀释好的DCFH-DA工作液，以覆盖住细胞为宜。

4）细胞清洗：用无血清培养基洗涤细胞1~2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

1.2收集细胞后装载探针（适用于贴壁细胞和悬浮细胞）

1）细胞准备：按照标准方法培养细胞，必须保证检测所用细胞状态健康。按照适当方法，清洗并收集足量的细胞。

2）诱导：将收集好的细胞悬浮于适量稀释好的药物，于37℃细胞培养箱内避光孵育，具体诱导时间根据诱导物本身特性，以及细胞类型来决定。

3）探针装载：离心去除上清，收集细胞，加入浓度为10μM的DCFH-DA探针，以覆盖住细胞为宜。

4）细胞清洗：用无血清细胞培养基洗涤细胞1~2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
2.检测

1）原位装载探针法：激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

2）收集细胞后装载探针：用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，也可以用激光共聚焦显微镜直接观察。