WB实验之内参蛋白的选择

在进行WB（Western Blot）实验时，选择合适的内参确实至关重要。内参的主要作用是像一把“尺子"，用来衡量和校正每个样本的上样量，以及在上样过程中可能产生的实验误差。这样，我们就可以更加确信实验结果的准确性，因为它们已经经过了内参的校正。

一、选择内参需要遵循的原则？

1. 样本种属来源

匹配性原则：内参蛋白的选择应基于实验样本的物种来源。对于哺乳动物细胞和组织样本，常用的内参包括β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B等。这些蛋白在哺乳动物细胞中表达稳定，适合作为内参。

跨物种反应性：当研究涉及多个物种时，应选择具有广泛物种反应性的内参，或根据具体物种选择特异性内参。

2. 目的蛋白分子量

分子量差异：为了避免信号干扰和图像解析的复杂性，内参蛋白的分子量应与目的蛋白保持显著差异。一般建议内参蛋白与目的蛋白的分子量相差5kDa以上。

3. 目的蛋白表达部位

亚细胞定位：根据目的蛋白在细胞内的定位选择相应的亚细胞器内参。例如，核蛋白检测可选择Lamin A、Lamin B、Histone H3等核内参；膜蛋白检测可选择ATP1A1等膜内参；线粒体蛋白检测可选择VDAC1和COX IV等线粒体内参。

表达一致性：确保内参蛋白与目的蛋白在细胞内的表达部位一致，以提高实验结果的内部一致性。

4. 实验条件影响

稳定性评估：在选择内参时，需要充分了解实验条件对内参蛋白表达的影响。某些实验条件（如缺氧、糖尿病、药物处理等）可能会导致特定内参蛋白的表达水平发生变化。

适应性选择：选择那些在实验条件下表达稳定、受影响较小的内参蛋白。例如，在缺氧条件下，GAPDH的表达可能会增高，因此不适合作为内参；而在凋亡实验中，Lamin等也可能不适合作为内参。

5.文献参考和实验验证

文献查阅：查阅相关文献了解不同内参蛋白在不同实验条件下的表现，以获取有价值的参考信息。

二、选择内参的注意事项

选择内参的注意事项主要包括考虑目的蛋白分子量、种属特异性、蛋白表达位置、试验处理条件对内参表达的影响，以及确保内参蛋白的稳定性。‌

‌1. 目的蛋白分子量‌：

选择内参抗体时，应考虑目的蛋白分子量的大小，通常应保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KDa以上。例如，如果目的蛋白分子量为45KDa，则不宜选择分子量为42KDa的β-actin作为内参，而可以考虑选择分子量为36KDa的GAPDH作为内参‌。

‌种属特异性‌：不同种属的样本内参蛋白不同。例如，哺乳动物的组织或细胞样本通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH等，而植物来源的实验样本则可能选择Plant actin、Rubisco等‌。

‌2. 蛋白表达位置‌：

内参的选择还需考虑蛋白的表达部位。不同的表达部位可能需要不同的内参蛋白。例如，细胞骨架相关的研究不宜选择β-actin作为内参，因为β-actin是细胞的一种重要骨架蛋白，其表达量非常丰富，但在某些特殊情况下，如脂肪组织中，β-actin的表达量很少，此时β-actin就不再适用‌。

‌3. 试验处理条件‌：

试验处理条件对内参表达的影响也是一个重要的考虑因素。例如，GAPDH是糖酵解过程中的酶，关于糖代谢的研究（如糖尿病模型）中不宜选择GAPDH作为内参，因为某些细胞中缺氧也会影响GAPDH的表达。此外，肿瘤组织中的GAPDH相对于正常组织是高表达的，有文献报道GAPDH可以作为肿瘤标志物，因此在比较肿瘤组织与正常组织时，也不宜选择GAPDH作为内参‌。

‌4. 内参蛋白的稳定性‌：

内参蛋白的稳定性是选择内参的关键因素之一。内参蛋白应能在不同的实验条件下保持相对稳定的表达水平，以确保实验结果的准确性。内参蛋白的稳定性可以通过实验前的样品前处理来保证，但在某些特殊条件下，内参蛋白的表达也可能发生变化‌。

三、常用内参