qPCR的CT值为何定在15-35之间？

一、扩增曲线

扩增曲线是描述PCR动态进程的曲线，扩增曲线一般以循环数(Cycle number)为横坐标,荧光强度(Fluorescence intensity)或信号量(Signal amount)为纵坐标。典型的扩增曲线可以分成四个时期：基线期、指数期、线性期和平台期。

基线期：扩增曲线的水平部分，通常在PCR反应的前几个循环（3-15个循环）内。此阶段扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物生成量的变化。仪器软件会基于这阶段的荧光信号计算出基线范围。

指数期：PCR扩增的指数增长阶段，扩增曲线起峰。此时期所有反应试剂均有盈余，DNA聚合酶保持高水平的活力，每个循环的产物量与初始模板量符合指数关系。这是进行定量分析的最佳时期，因为PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系。

线性期：随着原料的消耗、产物的积累、酶活的损耗等，DNA的扩增不再呈指数扩增，荧光信号的增长也逐渐放缓，反应效率降低。产物量与初始模板量不再符合指数关系。

平台期：由于底物耗尽、酶活性降低等因素，荧光信号不再增加，趋于平稳。每个反应进入平台期的时间和平台期的高低各不相同。

二、熔解曲线

熔解曲线（Dissociation curve）是随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。它用于分析PCR产物的浓度、特点和纯度。

原理：PCR反应结束后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生熔解曲线。随着温度上升，DNA双链逐渐解开，荧光染料从双链中释放出来，荧光信号降低。当温度达到DNA双链解链50%时，对应的温度称为熔解温度（Tm）。

曲线分析：

单峰曲线：如果qPCR产物非常特异，熔解曲线在80-90℃之间会形成一个单峰。这表明只扩增到了目的基因，没有非特异性扩增产物。

前置杂峰：在主峰前有一个前锋，可能是比目的片段短些的非特异性片段，在温度低一些的时候就能解开双链，也可能是引物二聚体。

后置杂峰：躲在主峰后面的是比目的片段长些的非特异性片段，在温度高一些的时候才能解开双链。

宽峰：如果非特异性产物Tm值与目的条带的Tm值接近，熔解曲线可能出现宽峰。

扩增循环数（Cycle Threshold，Ct）在qPCR（实时荧光定量PCR）中是一个关键参数，代表PCR扩增过程中，荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数。

三、Ct值的定义

Ct值：全称为Cycle Threshold，即在PCR反应中，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。简单来说，就是荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。

Ct值的意义与范围

Ct值与模板量的关系：衡量PCR扩增过程中荧光信号达到设定阈值的循环次数。‌ Ct值越小，表示样本中靶标核酸的起始拷贝数越多；Ct值越大，则表示起始拷贝数越少‌Ct值与起始模板量的对数存在线性关系。

Ct值的范围：在正常情况下，Ct值的范围通常在15-35之间。Ct值小于15可能意味着扩增在基线期范围内，未达到荧光阈值；而Ct值大于35则可能意味着模板起始拷贝数过低，扩增效率不佳或存在非特异性扩增，结果无意义。

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