小鼠游离皮质培养试剂盒怎么使用？

买到了BrainBits小鼠游离皮质培养试剂盒后，该如何使用呢？

一、制剂（无菌罩室温）：

1. 将80µl台普兰蓝（Sigma T8154）加入0.5ml试管中进行下面的步骤4。

2. 12ml NbActiv1™至室温。

3. 将2ml分离的初级神经元管置于30℃水浴中加热1分钟。

二、细胞分散（无菌罩室温）：

1. 用硅化巴斯德移液管，将整个试管的内容物转移到无菌15ml离心管中。

2. 旋转1100rpm (200 x G)， 1分钟。丢弃上清，留下约50µl含有微球的THRYVE胚胎wanquan液。

3. 分散细胞颗粒（用手指或管轻弹管底部），重悬于1ml NbActiv1™中。

4. 将20µl细胞液加入含有80µl台盼蓝（1:5稀释）的0.5ml试管中。

5. 使用血细胞计（计算细胞/ml）或使用当前的实验室程序计数细胞。

三、细胞电镀（无菌罩室温）：

1. 用NbActiv1™稀释0.2ml/cm2的细胞，用16000个细胞/cm2或所需浓度的平板。

2. 37℃，5% CO2, 9% O2, 95%湿度（或环境O2）孵育。

3. 4天后，神经元显示轴突和树突；突触和动作电位开始于7天。

4. 每3-4天用新鲜的37℃CO2平衡NbActiv1™更换一半的培养基。

四、细胞镀96孔板：

1. 用NbActiv1™以0.2ml/cm2稀释细胞，并以10,000个细胞/孔（SD）和35,000个细胞/孔（C57/BL6）或所需的浓度进行平板稀释

浓度。

2. 将钢板放在工作台顶部（而不是在引擎盖下），并将边缘用薄膜包裹15-20分钟，使其均匀沉降。

3. 除去副膜，37℃，5% CO2, 9% O2, 95%湿度（或环境O2）孵育。

4. 4天后，神经元显示轴突和树突；突触和动作电位开始于7天。

5. 每3-4天用新鲜的37℃CO2平衡NbActiv1™更换一半的培养基。

五、可行性分析:

1. 用37℃HBSS （0.2ml/cm2底物）冲洗两次。

2. 用15mg/ml双醋酸荧光素的丙酮原液和4.6mg/ml碘化丙啶的水原液配制染料混合物。

将每种15µl稀释到1.5ml HBSS中（1:100稀释）。

3. 在步骤1中加入的0.2ml HBSS中加入20µl染料混合物（1:10稀释）。

4. 约1分钟后，使用适合荧光素荧光的蓝色激励（绿色细胞）计数活细胞。计数死细胞

绿色激发为碘化丙啶荧光（小红核）。

5. 生存能力=（绿色细胞/单位面积）/（总细胞数/单位面积）或生存=绿色细胞/（绿色+红色细胞）。

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