如何降低非特异性扩增？

一、扩增方式

扩增方式一般有两种，对称扩增和不对称扩增。

1、对称扩增

使用等量的引物进行PCR扩增，扩增产物量随着PCR循环呈指数增长，一般的PCR，使用的都是这种方式。

由于TaqDNA聚合酶具有5’-3’外切酶活性，在PCR扩增的过程中会水解探针，导致探针被耗尽，无法用于熔曲分析；若使用抗酶切修饰的探针，可一定程度降低水解，但由于探针阻碍了聚合酶通过，扩增效率会大幅下降。

对称扩增产生的互补双链，会与探针竞争结合靶序列，不利于探针结合到靶序列上，熔曲分析可能会出现异常。

优点：灵敏度高

缺点：一般搭配使用媒介探针进行检测，而其他类型探针由于被切割而无法使用。

2、不对称扩增

上下游引物中，有一条引物为过量使用，一条引物xian量使用，在PCR扩增的前期，扩增产物量呈指数增长，待xian量引物耗尽，扩增产物量呈线性增长，产生大量的单链用于探针的结合和熔解曲线分析。

LATE-PCR方法中，由于考虑到引物浓度对引物Tm值的影响，xian量引物由于浓度低，对模板的结合效率下降，从而影响不对称扩增前期的扩增效率，因此对xian量引物的Tm值进行了增加（即加多几个碱基）。

优点：不会消耗探针，探针可用于后续熔解曲线分析

缺点：灵敏度低，一般用于基因检测，不适用于病原检测（病原检测需要高灵敏度）

二、如何降低非特异性扩增？

1、HANDS技术（Homo-Tag Assisted Non-Dimer System，同源加尾无二聚体系统）

通过对引物添加标签，当形成引物二聚体后，由于首尾的序列互补，会形成发夹结构，不再作为模板进行扩增。

2、DPO引物（Dual Priming Oligonucleotide，双启动寡核苷酸）

DPO引物主要由三个部分组成，长的 5'端片段、短的3'端片段、中间起连接作用的聚脱氧次黄嘌呤(poly I)。由于脱氧次黄嘌呤与天然碱基结合较弱，因此相当于与模板DNA形成了一个气泡结构。

即使DPO引物的较长的 5'端部分结合到了非靶序列部位，但由于热力学限制，3’端部分阻止了非特异结合并有效地阻断了延伸。同样由于热力学限制，单独的3'端部分在PCR退火温度下不能结合到靶序列上。从而减少引物二聚体的扩增。

3、touch-down技术

即降落PCR，在退火阶段，采用逐级降温的方式，能有效减少非特异性扩增。温度较高时，由于非特异性结合的结合力较弱，不利于非特异性扩增，特异性扩增占优势。

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